AI增强多重LAMP联合CRISPR/Cas12b微流控平台，实现食源性病原菌现场超灵敏检测

在食品安全检测中，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7和副溶血性弧菌都是需要重点关注的病原菌。它们可能出现在肉制品、蛋制品、水产品和即食食品中。消费者食用受污染食品后，可能出现腹泻、发热、呕吐等症状，严重时还会引发更复杂的感染。世界卫生组织相关报告显示，食源性病原菌感染每年可导致全球超过6亿例急性胃肠炎病例，约42万人因此死亡。婴幼儿、老年人以及免疫功能较弱的人群，往往面临更高风险。

水产品的加工和流通过程尤其容易出现交叉污染。鱼、虾、贝类以及蛋类水产制品，在加工、运输、销售和冷藏期间都可能接触到污染源。冰鲜产品如果使用了受污染的制冰水，或者接触环境卫生状况不佳，同一样品中同时存在多种病原菌并不奇怪。也正因为如此，单独检测一种菌已经很难覆盖实际筛查需求。能够一次检测多种目标、尽量缩短等待时间，并在现场完成操作的技术，更符合食品企业、市场监管和口岸检验的使用场景。

目前常见的检测手段包括培养法、免疫分析和核酸检测。培养法需要经历增菌、分离和鉴定，完整流程通常要3–7天；ELISA和免疫层析可以把时间压缩到数小时，但对食品基质较敏感，低浓度样品的灵敏度也有限。PCR灵敏度高，却离不开温控设备、核酸提取和相对规范的实验条件。多重PCR虽然能够在一次反应中检测多个靶标，但流程更复杂，扩增产物污染风险也随之增加。

LAMP等恒温扩增技术近年受到关注，主要是因为它对设备的要求相对较低，反应速度也较快。不过，LAMP的非特异性扩增问题一直存在，在多重体系中，假阳性和通道间信号干扰可能更加明显。CRISPR/Cas系统可以对扩增产物进行二次序列识别。Cas12a、Cas12b等蛋白在识别目标后会被激活，并切割荧光报告探针。把恒温扩增与CRISPR识别结合起来，可以在一定程度上兼顾反应速度和识别特异性。

近期，《Sensors and Actuators: B. Chemical》发表了一项相关研究。研究团队构建了一种AI增强多重LAMP联合CRISPR/Cas12b的离心微流控检测平台，简称AI-LCM，用于同步检测水产品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7和副溶血性弧菌。该平台把多重荧光探针LAMP、CRISPR/Cas12b识别、空间编码离心微流控芯片和XGBoost算法放在同一个检测体系中。从加入提取核酸到输出结果，约30 min即可完成；检测限低至1 CFU/mL，AI分类准确率达到98.41%。

研究团队还用24份人工加标样品和50份真实水产品样品对平台进行了验证，样品包括海鸭蛋、三文鱼、虾和蛤蜊。结果显示，AI-LCM与qPCR及传统培养法具有较高一致性，说明该方法在复杂食品样品中具有一定适用性。

检测流程：先扩增，再由芯片完成分区识别

AI-LCM的检测流程包括样品核酸提取、mLAMP扩增、离心分液、CRISPR/Cas12b检测、荧光采集和AI判读。研究人员先从食品样品中提取细菌基因组DNA，再把模板加入离心微流控芯片的LAMP扩增腔。四种病原菌分别对应不同靶基因：金黄色葡萄球菌为nuc，副溶血性弧菌为toxR，沙门氏菌为fimY，大肠杆菌O157:H7为rfbe。每个靶标配有不同荧光标记，便于区分扩增结果。

mLAMP探针由带淬灭基团的FIP引物和带荧光基团的FD序列组成。没有目标序列时，荧光基团与淬灭基团距离较近，信号较弱；目标序列发生扩增后，FD序列被释放，产生第一阶段荧光。接下来，扩增产物和游离FD序列在离心力作用下进入空间编码的CRISPR检测腔室。每个腔室预装特定的Cas12b/sgRNA复合物，以及与目标对应的ssDNA荧光报告探针。

研究中使用的是来源于酸热脂环酸杆菌的AapCas12b。该酶在约65 ℃下仍能保持较好的稳定性和切割活性，与LAMP反应温度较为匹配。在sgRNA引导下，Cas12b先识别扩增产物中的PAM序列，随后被激活。激活后的Cas12b既能切割目标双链DNA，也会产生旁切活性，进一步切割FD序列和ssDNA报告探针。

FD序列和对应报告探针使用相同的荧光标签。两类底物先后被切割后，信号可以在同一通道内叠加。这不是传统意义上用两种不同检测信号互相验证，而是把LAMP释放FD产生的信号，与CRISPR切割报告探针产生的信号放在同一荧光体系中，从而增强弱阳性样品的可识别程度。

封闭式离心芯片，减少扩增产物外泄

为了适应现场检测，研究团队设计了封闭式离心微流控芯片。芯片直径80 mm、厚度3 mm，主体材料为PMMA。微通道和反应腔通过CNC精密加工形成，通道表面经过亲水处理，使液体能够在离心力和重力作用下稳定移动。芯片顶部用低荧光背景的透明压敏胶膜密封，既可以防止液体泄漏，也不会妨碍实时荧光采集。

每张芯片包含6个旋转对称的检测单元。每个单元由一个LAMP扩增腔、一个分液结构、一个废液腔和4个环形排列的CRISPR/Cas12b检测腔组成。LAMP扩增腔预装25 μL反应体系。扩增结束后，芯片先以1200 rpm旋转15 s，使产物进入分液结构；随后以2400 rpm旋转30 s，每个检测腔分配2 μL扩增产物，多余液体进入废液腔。四个CRISPR腔室分别对应沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7和副溶血性弧菌。

封闭设计的实际意义在于减少人工开盖和移液。LAMP和CRISPR虽然在同一芯片内完成，但被安排在不同反应区域，既保留了两步反应各自的条件，又减少了扩增产物转移过程中形成气溶胶污染的可能。

研究团队还配套开发了便携式检测仪。仪器体积约23 cm × 21 cm × 14 cm，重量约12.5 kg，内部包括高精度伺服电机、空气加热控温模块和四通道荧光检测模块，可以完成芯片旋转、恒温反应、荧光激发和信号采集。操作人员通过图形化界面启动程序，仪器便可自动运行。无线通信模块则可以把检测数据发送到移动端或云平台，便于现场记录和后续管理。

图1 AI-LCM检测流程示意图[1]

多重检测的特异性和灵敏度

在方法建立阶段，研究团队分别对mLAMP和CRISPR/Cas12b体系进行优化。mLAMP部分主要考察多重扩增能力、Bst DNA聚合酶用量、引物比例、特异性和灵敏度；CRISPR部分则围绕sgRNA筛选、Cas12b/sgRNA复合物浓度、缓冲体系和信号增强效果展开。

特异性实验选用了10种食源性相关细菌。结果显示，某一sgRNA只有在对应目标DNA存在时才产生明显荧光，非目标菌和无模板对照均低于设定阈值。芯片图像也呈现出相同结果：亮荧光只出现在相应病原菌的检测腔室，其他腔室没有明显信号。统计结果显示，非目标组与无模板对照之间没有显著差异，说明该平台具有较好的特异性，交叉反应相对较少。

在不使用AI早期判读的情况下，mLAMP-CRISPR/Cas12b体系对4种目标菌的检测限可达到10⁰ CFU/mL，即约1 CFU/mL。这个结果与双重荧光增强有关：前端mLAMP提供扩增，后端Cas12b再次识别并切割报告探针，两者共同提高了最终信号。

精密度和重复性测试也纳入了评价。在10² CFU/mL混合菌液条件下，4种病原菌的平均荧光强度均保持在较高水平。批内CV为4.35%–9.01%，批间CV为6.06%–12.69%。副溶血性弧菌通道的批间CV最高，为12.69%，但整体结果仍显示出较好的重复性。

XGBoost读取的不只是终点荧光

传统LAMP-CRISPR检测往往依赖终点荧光阈值。高浓度阳性样品通常容易判断，低浓度样品就没那么简单了：曲线上升可能比较慢，短时间内还没有越过阈值，结果便容易落在“灰区”。如果坚持等到终点再判断，检测时间会被拉长；如果过早下结论，又可能出现假阴性。

为此，研究团队引入XGBoost机器学习算法，对实时荧光动力学曲线进行分析。仪器每10 s采集一次荧光强度，模型不仅读取原始信号，还提取了均值、标准差、变异系数、最大值、最小值和信号范围等统计特征，以及终点与起点的差值、比值、线性斜率和相邻时间点一阶差分等趋势特征。这些信息可以反映曲线是否已经出现早期放大迹象，以及其增长形态是否接近阳性样品。

模型训练数据共311条，其中阳性230条、阴性81条，并按64%、16%和20%的比例划分训练集、验证集和测试集。研究人员使用Optuna进行贝叶斯超参数优化，并以准确率、精确率和召回率评价模型。

结果显示，输入的时间点越多，模型的分类表现越好。只使用前30个时间点，也就是约5 min的CRISPR反应数据时，XGBoost准确率已经达到98.41%；使用60个时间点，即约10 min数据时，准确率、精确率和召回率均达到100%。继续增加采样时间后，模型性能没有明显提升，说明早期曲线信息已经足够支持判断。

从误判样本看，阴性样品通常在反应早期就能被识别，真正需要更多时间的是接近检测限的低浓度阳性样品。AI模型的作用，不是简单比较某一个终点数值，而是把曲线的形状、斜率和变化趋势一起纳入分析。因此，即使样品尚未达到传统阈值，只要已经显现出阳性动力学特征，模型也有机会提前作出判断。

研究团队还比较了AI在LAMP阶段和CRISPR阶段的效果。LAMP阶段采用Extra Trees模型时，测试准确率为92.41%，对整体检测时间的压缩有限。相比之下，CRISPR反应本身带有信号放大能力，再结合XGBoost分析早期曲线，既能保持灵敏度，也能明显缩短检测时间。从这项研究的结果看，把AI放在CRISPR阶段更符合快速检测的目标。

人工加标和真实水产品样品验证

为考察复杂食品样品中的表现，研究团队选取虾、蛤蜊、三文鱼和海鸭蛋开展人工加标实验，共24份样品。样品分别加入沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌，浓度范围为10⁰–10⁴ CFU/mL，并与BAM参考方法进行比较。

样品处理流程为：取25 g样品，加入225 mL无菌盐水均质；离心收集沉淀后，用裂解液重悬；100 ℃加热10 min完成细菌裂解；取上清作为模板加入AI-LCM平台。每个浓度水平重复检测6次。

结果显示，AI-LCM与BAM参考方法的整体一致率达到95.42%。虾和蛤蜊中盐分、蛋白质含量较高，三文鱼脂肪含量较高，海鸭蛋的样品组成也比较复杂。在这些基质差异明显的样品中，平台仍保持了较高一致率，说明mLAMP-Cas12b体系和AI判读对复杂基质具有一定适应性。

当然，加标实验更多反映的是受控条件下的分析性能，不能完全替代自然污染样品验证。自然样品中的病原菌可能处于受损或低活性状态，分布也不一定均匀，样品前处理和核酸提取效率同样会影响最终结果。为此，研究团队又收集了50份真实水产品样品，包括虾、蛤蜊、三文鱼和海鸭蛋，并使用AI-LCM、BAM培养法和qPCR进行平行检测。

这些样品先用BPW缓冲蛋白胨水均质，再在37 ℃、200 rpm下培养18 h，之后提取基因组DNA进行检测。BAM方法检出4例单一感染和1例混合感染。对于沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌单一感染样品，AI-LCM与BAM结果完全一致；副溶血性弧菌方面，AI-LCM检出2例阳性，而BAM确认1例阳性。混合感染样品中，两种方法结果一致。

Cohen's kappa分析显示，在沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌检测中，AI-LCM与BAM达到完全一致，Kappa值均为1.00；副溶血性弧菌检测的一致性处于可接受水平。

与qPCR比较时，AI-LCM检出6份阳性样品，qPCR检出5份。差异主要出现在第20号样品：AI-LCM判定为沙门氏菌阳性，而qPCR结果为阴性。研究团队认为，食品基质中的成分可能对qPCR扩增产生了抑制。另一个混合感染样品中，qPCR漏检了大肠杆菌O157:H7，AI-LCM则检出该菌。第25号样品中，AI-LCM和qPCR均检出副溶血性弧菌，但BAM未检出，研究认为这可能与细菌处于活的非可培养状态有关。

从这组真实样品结果看，AI-LCM与BAM总体保持了较好一致性，检测时间则明显缩短。与qPCR相比，该平台对复杂基质中的弱信号有较好的捕捉能力。不过，具体差异还需要更多自然污染样品和不同实验条件下的数据来验证，不能仅凭现有样本数量作出过度外推。

从实验室平台走向现场检测，还需要解决什么

这项研究把多重恒温扩增、CRISPR特异性识别、封闭式离心微流控和荧光曲线分析组合起来，形成了一套相对完整的现场检测方案。对于低浓度病原菌，传统终点阈值可能需要等待较长时间；XGBoost则可以利用早期曲线变化，提前识别阳性趋势。封闭芯片还减少了扩增产物外泄和气溶胶污染，为现场操作提供了便利。

食品生产企业在原料验收、过程控制、成品放行和环境监测中，都有多种病原菌同步筛查的需求。第三方检测机构关注样品周转效率，市场监管和口岸检验部门则希望更快获得初筛结果。目前，环凯等企业已经围绕沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7和副溶血性弧菌等建立了较成熟的检测产品和服务体系，包括培养基、测试片、核酸快检试剂盒和标准方法配套试剂等。AI-LCM属于前沿集成检测路线，未来更可能与这些成熟方案形成互补。

如果要进一步提高实际可用性，后续工作可以从几个方面推进。样品裂解、核酸提取、扩增检测和废液处理最好逐步集成到芯片中，使操作者尽量只需完成样品加入和结果读取。检测靶标也可以继续扩展，通过更换LAMP引物、sgRNA和荧光通道，覆盖单核细胞增生李斯特菌、蜡样芽胞杆菌、阪崎克罗诺杆菌等其他重点病原菌。

AI算法本身也需要更大的训练数据库。不同食品基质、菌株、仪器型号和试剂批次，都可能改变荧光曲线形态。只有把这些变化纳入训练数据，才能更好地评价模型的泛化能力。此外，温度波动、操作人员差异、样品保存状态和运输条件，也应在现场环境中逐项验证。

总体而言，AI-LCM完成了从核酸扩增、CRISPR识别、芯片分液到荧光判读的一体化设计，兼具多目标检测、封闭式防污染和早期智能判读等特点。研究结果表明，它能够在较短时间内检测多种食源性病原菌，并在真实水产品样品中获得较好的一致性。下一步能否真正走向食品生产现场、市场监管和口岸检验，取决于芯片量产、试剂预封装、设备便携化以及算法标准化等环节能否同步推进。

参考文献：[1] Ma B, Huang Z, Tang Q, Zhang X, Wang W, Sun K, Ye Z, Shentu X, Zhan W, Zhang M, Ma G, Yu X. AI-enhanced multiplex LAMP coupled with CRISPR/Cas12b on a microfluidic platform for ultrasensitive on-site detection of foodborne pathogens. Sensors and Actuators: B. Chemical. 2026;466:140312. https://doi.org/10.1016/j.snb.2026.140312.

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