使用修饰适配体纳米MOF双重识别策略快速精确检测蜡样芽孢杆菌

　　背景：

　　目前蜡样芽孢杆菌分析的策略包括基于微生物生理生化特性的平板培养、基于抗原-抗体免疫反应的酶联免疫吸附测定(ELISA)和基于核酸扩增的聚合酶链反应(PCR)。培养依赖性方法被认为是鉴定和鉴别细菌的金标准，但这种方法费力费时，难以进行现场检测。ELISA因其优异的特异性、高通量和低成本而被广泛用于细菌检测。然而，作为一种异质检测，ELISA需要连续洗涤程序，增加了交叉污染和假阳性的风险。此外，抗体还面临着特定细菌品种不足和稳定性较差的挑战。PCR具有很高的灵敏度，但需要复杂的核酸提取步骤和熟练的操作。因此，鉴于当前细菌分析策略的局限性，迫切需要探索一种简单、低成本和精确的蜡样芽孢杆菌检测策略。

　　与传统的细菌检测方法相比，生物传感策略被认为是一种更方便的选择，成本更低。作为替代方案，多种生物传感器，如光学、电化学和压电传感器，已被应用于细菌的有效检测。作为光学传感器的主要成员，荧光生物传感器具有灵敏度高、操作简单、分析过程快等优点，已成为食源性病原体常规和床旁监测的有前途的候选者。在过去的十多年里，金属有机框架(MOF)作为高效稳定的发光传感器，已成为各种分析物(如离子、环境污染物、有毒气体、生物大分子和细胞)的高效、稳定的发光传感器。与有机染料、贵金属颗粒和量子点等常见荧光材料相比，MOFs具有比表面积更大、光稳定性更高、荧光产率更高、孔隙可调、可接近、各种官能团易于改性等特点。有吸引力的是，先前的研究表明，MOFs的整体尺寸可以缩小到纳米级，并且在实际应用中，所获得的纳米MOFs通常比相应的块状晶体表现出相当大的性能增强。然而，根据我们所知，纳米MOF尚未被用作细菌检测的荧光生物传感单元。

　　图1.(a)编写FcMBL@NM5AN;(b)使用双重识别策略测定混合物中的蜡样芽孢杆菌。

　　方法：本研究基于广谱纳米MOF荧光探针和适配体偶联磁性纳米颗粒(Apt-MBs)构建荧光双位点识别检测平台，用于食品和蒸馏酵母样品中的蜡样芽孢杆菌定量分析(方案1)。具体而言，通过纳米尺寸MIL-53(Al)-NH的改性合成了荧光生物传感探针，并与甘露糖结合凝集素偶联(FcMBL);FcMBL能够与病原菌外表面的末端甘露糖和岩藻糖残基连接。Apt-MBs用于特定的蜡样芽孢杆菌富集。与传统的识别单元抗体相比，适配体具有更高的特异性、非免疫原性、更小的尺寸和更好的化学稳定性等优势。基于精心设计的双重识别方法，蜡样芽孢杆菌可在60 min内以较宽的线性范围进行分析，检测限低，对真实样品的可靠性令人满意，从而对食品安全、社区健康、传染病诊断和酒类行业产生重大影响。

　　结果：如图4a所示，当蜡样芽孢杆菌浓度升高时，339 nm处的荧光强度相应增加。线性关系(R2=0.996)之间的信号强度(ΔF=F-F0.其中F0、F是指添加FcMBL@NM5AN前后沉淀物的荧光强度，蜡样芽孢杆菌的浓度范围为20×108 CFU/毫升。线性方程为ΔF = 817.07 log1/2NB. cereus + 32.98.其中N为蜡样芽孢杆菌代表蜡样芽孢杆菌的浓度(图4b)。计算出双重识别蜡样芽孢杆菌生物传感方法的检出限(LOD，3σ)为4 CFU/mL。

　　由于引起食物中毒和肠道疾病的细菌种类繁多，因此必须研究所提方法的特异性。在这里，我们验证了这种方法对蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的特异性。将低浓度蜡样芽孢杆菌与高浓度干扰细菌(包括金黄色葡萄球菌和大肠杆菌)混合，可检测到约20 CFU/mL的蜡样芽孢杆菌(图4c、d)。因此，提出的策略对目标细菌具有高度选择性和敏感性，具有超灵敏和高效蜡样芽孢杆菌定量的巨大潜力。

　　图2. 不同水平蜡样芽孢杆菌双重识别分析策略的荧光光谱(a)和校准曲线(b)。(c)蜡样芽孢杆菌对干扰物种(金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，108 CFU/mL)。(d)琼脂平板上的细菌为原始细菌溶液、富集沉淀和上清液。

　　结论：建立了一种基于荧光纳米MOFs双重识别和磁分离的蜡样芽孢杆菌快速超灵敏分析策略。得益于蜡样芽孢杆菌的特异性捕获和荧光纳米MOF的出色传感特性，该生物传感系统具有显著的蜡样芽孢杆菌监测定量能力，范围从20到2×108 CFU/mL，LOD为 4 CFU/mL。通过检测牛奶、大米、鸡肉、鸡蛋和蒸馏酵母中的蜡样芽孢杆菌水平，证实了其应用潜力，回收率令人满意。值得注意的是，通过交替使用特定的适配体，应用于所提出的双重识别平台中的细菌捕获器Apt-MBs可以很容易地扩展到分析其他食源性微生物。

　　参考来源： Yan J, Chen L, Teng M, et al. Dual recognition strategy for the rapid and precise detection of Bacillus cereus using post-modified nano-MOF and aptamer[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2023. 386: 133745.