基于单原子纳米酶的比色传感器阵列识别口腔致龋菌

近日，一项关于龋齿检测技术的最新研究引起了医学界的广泛关注。龋齿作为一种常见的慢性感染性疾病，严重影响着全球人口的口腔健康。专家指出，这种疾病主要由口腔中的细菌分解食物中的碳水化合物产生酸所致，进而导致酸性环境滋生更多致龋细菌。据了解，变形链球菌、嗜酸乳杆菌、血链球菌和唾液链球菌等是引发龋齿的主要“元凶”。准确识别这些细菌对于评估龋病风险、进行分级诊断和制定治疗方案至关重要。然而，目前广泛使用的检测方法如传统培养、生化鉴定、免疫学和分子生物学方法，虽然可靠但存在耗时长、操作复杂、对技术人员要求高等缺点，难以满足快速检测多种细菌的需求。为突破这一瓶颈，科研人员开发出了一种创新的检测技术。这种技术借鉴了哺乳动物的嗅觉和味觉系统，设计出高通量的比色传感器阵列。这种传感器通过非特异性识别元素产生独特的复合响应模式，巧妙地克服了传统"锁-键"识别方法的局限性。研究表面，结合先进的机器学习技术，如线性判别分析和层次聚类分析，新型传感器能够有效区分各种目标细菌。特别值得一提的是，纳米酶，尤其是单原子纳米酶在这一技术中发挥了关键作用，它们作为识别元件具有高灵敏度、经济实用、稳定耐用等优势。尽管如此，这项新技术仍面临一些挑战。比如，如何从复杂的唾液样本中准确检测出低浓度的龋菌，以及如何进一步提高传感器的多重检测能力、灵敏度和适用性等问题仍需解决。未来研究的重点将是开发更高效、更灵活的检测技术，以适应不同的临床需求，提高检测精度。这不仅将推动龋齿诊断技术的进步，也有望为其他口腔疾病的早期诊断和预防提供新的思路。

基于此，上海大学生命科学学院的研究者提出了一种基于Fe-N-C SANs，并在机器学习辅助下用于鉴定龋齿细菌的比色传感器阵列。检测原理如图1所示，采用一般离子盐辅助合成方法制备的Fe-N-C SANs和Fe-N-C-尿素SANs均具有类似氧化酶的活性。在致龋菌存在的情况下，Fe-N-C SANs的电子跃迁能力提高，电子传递速度加快，类氧化酶活性增强。相反，Fe-N-C-Urea SANs的催化活性位点可能被龋菌遮挡，导致其氧化酶样活性减弱。因此，不同龋菌结合的SANs催化的3,3'，5,5'-四甲基联苯胺（TMB）的吸光度值是不同的。此外，SANs的氧化酶样活性在致龋菌混合物中也不同。机器学习可以用来评估各种致龋细菌的传感器阵列的比色响应模式。该分析可以利用LDA提供每种致龋细菌的独特“指纹”。

图1 检测原理图

研究人员采用一般离子盐辅助合成方法，以氯化钾晶体为模板制备了单原子纳米酶（SANs）。通过一系列先进的表征技术，如扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、高角度环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADF-STEM）、能量色散X射线光谱（EDS）和X射线光电子能谱（XPS）等，对SANs的形貌、结构和元素组成进行了详细分析。结果表明，SANs呈现类似石墨烯的薄层结构，具有分层多孔特性，且铁原子以单原子形式均匀分布在碳骨架中。研究还证实了SANs中存在Fe-N配位结构，这被认为是其催化活性的关键。随后，研究人员评估了SANs的类氧化酶活性，以四甲基联苯胺（TMB）作为底物进行催化氧化实验。通过优化反应条件并应用Michaelis-Menten动力学模型，确定了SANs的催化参数。结果显示，掺杂尿素的SANs表现出更优异的催化性能，这可能是由于尿素改变了单原子催化位点周围的局部氮配位环境。最后，通过一系列对照实验和抑制实验，研究人员进一步验证了SANs的催化机理，确认了铁原子是其类氧化酶活性的关键活性位点。此外，实验还证实了SANs具有优异的稳定性，为其在实际应用中的潜力提供了支持

图2. A）SANs合成示意图。B）扫描电镜图像，C）透射电镜图像，D）Fe-N-C SANs的EDS元素映射。E）扫描电镜图像，F）高角环形暗场扫描透射电镜（HAADF-STEM）图像，G）Fe-N-C-Urea SANs的EDS元素图。H）Fe-N-C SANs和Fe-N-C-尿素SANs存在时，652 nm处吸光度随时间的变化。插图：Fe-N-C SANs和Fe-N-C-尿素SANs的类氧化酶活性示意图。I）Fe-N-C SANs和Fe-N-C-尿素SANs的Michaelis-Menten曲线。

研究人员发现，龋菌显著提高了Fe-N-C SANs的氧化酶样活性，而Fe-N-C-尿素SANs的氧化酶样活性则有所降低（图3A、B和S9）。这表明龋菌与SANs之间存在相互作用。通过扫描电子显微镜观察，Fe-N-C SANs和Fe-N-C-Urea SANs表面均存在大量细菌（图2C、D和图S10）。细菌的加入导致Fe-N-C SANs和F-N-C-Urea SANs的zeta电位发生变化（图S11），进一步证明龋齿细菌可以与这两种SANs结合。

龋齿细菌和SANs的相互作用主要由氢键、静电力、范德华力和疏水相互作用引起。实验还表明，Ala、Trp、Ser、Arg、Asp和葡萄糖的加入不影响Fe-N-C SANs和Fe-N-C-尿素SANs的催化活性，表明催化活性的变化主要归因于龋菌本身的复杂结构（图S12）。通过紫外光电子能谱（UPS）评估了功函数（WF），以确定能带能水平，这是分析界面电子转移行为的关键参数（图2E）。结果显示，Fe-N-C SANs的二次电子截止能为16.84 eV，计算得出其WF为4.38 eV。Fe-N-C SANs与龋齿菌结合后，cutoff变为19.03 eV，对应WF为2.19 eV。WF的降低表明电子跃迁能力的提高，从而显著增加了Fe-N-C SANs的氧化酶样活性。

此外，龋齿菌对Fe-N-C-Urea SANs氧化酶样活性的抑制作用，可能是由于龋齿菌对Fe-N-C-Urea SANs活性部位的掩膜作用。

图3. A）龋菌对Fe-N-C SAN催化的正向调控和对Fe-N-C-尿素SAN催化的负向调控示意图。B）不同龋菌存在下SANs催化TMB氧化的吸光度值（n = 3个独立反应）。C） Fe-N-C SANs和D） Fe-N-C-尿素SANs与龋齿细菌孵育的SEM图像。He I测定E） Fe-N-C SANs和F） Fe-N-C SANs联合细菌的UPS光谱（hÍ1 = 21.22 eV）

之后，研究人员基于单原子纳米酶（SANs）构建了比色传感器阵列，用于鉴定10种不同的龋齿细菌。他们首先优化了检测条件，确定最佳孵育时间为30分钟，温度为37℃。使用Fe-N-C SANs和Fe-N-C-Urea SANs分别检测了10种致龋菌，包括变形链球菌、血管链球菌、唾液链球菌等。随着龋菌浓度从102 CFU/mL增加到107 CFU/mL，Fe-N-C SANs的吸光度值逐渐增强，而Fe-N-C-尿素SANs的吸光度值逐渐降低。研究人员采用线性判别分析（LDA）对吸光度值进行分析。结果显示，对于每种龋齿细菌，在六种不同浓度下的36个数据点可以清晰地分为6个簇。LDA评分图表明，不同浓度下的每种致龋细菌都能很好地区分开来。此外，因子1随着致龋菌浓度的增加呈线性增长。LDA方法还成功地鉴定出相同浓度下的10种致龋菌，将它们清晰地分为10个无重叠的簇。值得注意的是，不同属的细菌分布在不同区域，而同属的链球菌分布在邻近区域，表明该传感器不仅可以区分不同属的细菌，还具有区分同属龋齿细菌的潜力。层次聚类分析（HCA）进一步证实了这一点，显示出10种龋齿细菌对应的10个不同分支。研究人员还通过分子进化遗传学分析方法构建了这10种龋齿细菌的进化树，结果与HCA生成的树突图相符。总之，这项研究成功开发了一种基于单原子纳米酶的比色传感器阵列，能够有效区分和鉴定不同种类和浓度的龋齿细菌，为龋齿诊断提供了新的工具。

图4. 不同浓度下的吸光度值:A） 102 CFU mL - 1, B） 103 CFU mL - 1, C） 104 CFU mL - 1, D） 105 CFU mL - 1, E） 106 CFU mL - 1, F） 107 CFU mL - 1。G） SANs对10种牙源性细菌的LDA鉴别。H） HCA产生的10种不同致龋细菌的树突图。I）基于贝叶斯方法的10种蛀牙细菌进化树。

研究人员为了探索基于单原子纳米酶（SANs）的比色传感器阵列在鉴别口腔致龋细菌混合物中的能力，进行了多种实验。他们将两种不同的致龋细菌或不同比例的致龋细菌（1:0、1:1、1:5、1:10、5:1和0:1）进行混合，并利用传感器进行鉴定。结果显示，两种不同的致龋细菌或其不同混合比例可以轻松区分，无重叠现象，表明传感器在区分混合致龋细菌方面表现出卓越的能力。

图5. LDA用于区分无蛀牙细菌和存在。A） S. mutans与其他蛀牙细菌的细菌混合物，以及B） S. mutans UA159与S. gordonii不同比例的细菌混合物。

为了验证传感器的实用性，研究人员在人工唾液样本中测试了10种致龋细菌。结果显示，这些细菌被有效地分为10个不同的群体，与磷酸盐缓冲液中的结果一致，表明传感器具有强大的抗干扰能力，并在临床应用中具有潜力。进一步验证传感器的有效性，研究人员利用LDA对4个样品的吸光度值进行了分析，结果显示因子1的小提琴图分数与其他样本有显著差异。HCA分析进一步证明了这四个样本可以精确分类。受体工作特征曲线的分析表明，传感器对人工唾液样本中龋菌的鉴定具有高准确性。此外，将比色传感器阵列获得的S. mutans ATCC25175的浓度与铺板法进行比较，结果显示两种方法之间没有显著差异。为了研究传感器在复杂真实样本中鉴定致龋细菌的能力，研究人员采集了两名健康儿童和两名患龋儿童的唾液样本和牙菌斑样本。通过LDA分析，传感器成功区分了健康儿童和患龋儿童的唾液样本和牙菌斑样本，证明了基于SANs的比色传感器阵列在分析真实口腔样品中的能力，有望用于临床应用。

图6. A）人工唾液样品中SANs催化TMB氧化的吸光度值（n = 6个独立反应）。B）人工唾液样本中10种致龋细菌的LDA鉴别。4个人工唾液样本的C）因子1和D） HCA树突图。

本研究成功开发了一种基于单原子纳米酶（SANs）的比色传感器阵列，利用致龋菌对两种SANs催化活性的不同影响，结合机器学习技术，实现了对十种不同致龋细菌的检测和区分，即使浓度低至102 CFU/mL。该传感器阵列不仅能够识别混合致龋细菌，还能通过HCA树形图揭示不同细菌之间的相似性。传感器在人工唾液样本中的测试结果显示，其具有强大的抗干扰能力，能够准确识别不同细菌。基于SANs的比色传感器阵列为简单高效的牙源性细菌鉴定提供了一种新方法，在口腔疾病的预防和诊断中具有广阔的前景。

论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/smll.2024038784