一种新的基于RAA-CRISPR Cas 12 a系统的单增李斯特菌快速核酸检测方法

原创

来源：魏文杰

2024-08-16 11:52:25

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核心提示：近年来，成簇的规则间隔短回文重复序列/相关蛋白（CRISPR/Cas）系统由于其剪切外源基因组的能力而被广泛用于基因组编辑或生物大分子的特异性和超灵敏检测。重组酶介导等温核酸扩增技术（Recombinase Aided Amplification），简称RAA，该技术利用重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶在等温（39℃）条件下进行核酸扩增，结合荧光即时检测，实现5－20分钟输出结果，灵敏度达到10copies/测试。

单增李斯特菌能引起人畜共患疾病，人类感染可导致败血症、脑膜炎等，爆发后的死亡率为27%-44%，是自然界中广泛存在的最危险的食源性病原微生物之一。当前，食品中单增李斯特菌的检测主要依赖传统分离培养法，但此法灵敏度低、易遗漏、操作繁琐且耗时，难以满足实时监测需求；分子生物学和免疫学设备昂贵且需专业操作；恒温核酸检测技术（LAMP、Sers检测、生物传感器）操作复杂、技术要求高，限制了其在普通检测机构的普及与应用。设计和开发一种高特异性、高灵敏度、易操作的检测单增李斯特菌的方法对于食品安全和检疫检验具有重要的应用价值。近年来，成簇的规则间隔短回文重复序列/相关蛋白（CRISPR/Cas）系统由于其剪切外源基因组的能力而被广泛用于基因组编辑或生物大分子的特异性和超灵敏检测。

CRISPR/Cas系统是原核细胞中独特的适应性免疫系统，其基于由简单CRISPR RNA（crRNA）引导的核酸识别功能工作。当crRNA与互补的靶DNA或RNA片段结合时，Cas蛋白的剪切活性被触发。近年来，CRISPR/Cas系统检测技术因其靶向准确、特异性高、可多次检测等优点，在病原菌核酸实时检测领域引起了广泛关注。基于Cas 12 a蛋白靶向和反式切割单链DNA系统是简单和有效的这一特点，成功实现了病原体核酸检测，显著提高了方便食品检测产品的灵敏度。

本研究将CRISPR/Cas 12 a系统（RAA-CRISPR/Cas 12 a）与RAA技术相结合，为有效地控制和预防单增李斯特菌的传播和发展提供了理论依据。单增李斯特菌检测流程图如下：

用RAA-CRISPR/Cas 12 a对单增李斯特菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌等14种常见致病菌进行了检测。单增李斯特菌呈S型扩增曲线，荧光信号明显增强，而其他14种常见致病菌的扩增结果与阴性对照无差异，均为阴性。结果表明，RAA-CRISPR/Cas 12 a检测体系具有独立性，不受其他病原菌的限制，具有良好的特异性。

本文还对人工接种的单增李斯特菌进行了检测限和快速检测性能试验，并与国家标准方法进行了比较，传统国标方法在牛肉基质中的检出限为2.3 × 10-2 CFU/25 g，而RAA-CRISPR/Cas 12 a方法可以检出单增李斯特菌人工接种量为2.3 × 10-3 CFU/25 g，低于国家标准方法的检出限。使用初始污染水平为2.3 × 101 CFU/25 g的牛肉样品，用常规培养方法孵育4小时后才能检测到目标菌株，而用RAA-CRISPR/Cas 12 a方法孵育2小时后可以检测到单增李斯特菌。结果表明，本研究建立的RAACRISPR/Cas 12 a检测平台能够快速检测牛肉制品中的单增李斯特菌，具有比常规培养方法更低的检测限（2.3 × 10-3CFU/25 g）。用传统国标法对28个样品进行检测，结果与RAA-CRISPR/Cas 12 a的检测结果一致。该方法检测速度快，检出限低于国家标准方法（GB/T4789.30-2016）。

本研究将RAA整合到CRISPR/Cas 12 a系统中，建立了一种Cas 12 a介导的DNA检测技术，具有以下优点：第一，CRISPR/Cas系统的反应体积为20 µL，可以保证足够的核酸扩增效率，降低反应成本。第二，该系统是一种快速、灵敏、操作简单的现场检测技术。第三，特异性序列识别，设计了20多个短核苷酸的crRNA，结合RAA特异性扩增，使其具有高度的特异性。第四，该方法适用于在现场或在装备较差的实验室中在便携式恒温装置中快速检测食源性病原体。此外，与Cas9蛋白的顺式切割活性相比，本研究中选择的Cas 12 a同时具有顺式和反式切割活性，提供了更高的转换效率，并能够特异性地检测靶序列，且该CRISPR/Cas 12 a方法具有不依赖于仪器的优点。CRISPR/Cas 12 a的操作仅需简单的恒温操作，甚至便携式荧光分析仪也可进行现场快速检测。本文建立的方法不仅反应温度低，而且仅需一对引物即可特异性地完成检测。在食品检测产业链的最底层，医疗设施差、条件差的实验室，在需要紧急诊断的地方可以推广。

我们的CRISPR/Cas 12 a方法表明，CRISPR/Cas 12 a具有开发下一代核酸检测生物传感器的巨大潜力。在本研究建立的CRISPR/Cas 12 a系统中，在筛选Cas 12 a的最佳反应温度时，发现在42 ℃时扩增效率更快，而不是传统的37 ℃。此外，该方法可以与横向流动测试条技术相结合，使检测结果可以通过肉眼观察，达到视觉检测的目的。