基于层状金纳米颗粒酶促特性的A型流感病毒超灵敏可见检测

摘要:

近年来,呼吸道病毒导致的不可预知的传染病危机频发,疫情防控迫切需要快速、准确的检测手段。本文提出了一种基于层层组装生物素化金纳米颗粒(BGNPs)的超敏感比色免疫检测技术,实现了对甲型流感病毒(IAV)的可视化超高灵敏检测。

该检测方法采用连续的两步信号放大策略:首先通过亲和素-生物素作用,实现BGNPs在靶标病毒周围的层层堆积,大幅提升了检测信号强度;其次利用BGNPs的酶样活性,催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)氧化产生蓝色信号,进一步放大检测效果。这一协同的纳米探针系统显示出卓越的灵敏度,检出限低至101.29 EID50 mL-1,比商用快速检测试剂和传统酶联免疫吸附试验提高2500倍,并且检测时间仅需55分钟。此外,该系统具有抗干扰能力强、便携性好等优点,为现场病毒检测提供了一种先进、超敏感、及时的解决方案。

1. 引言

近几十年来,由呼吸道病毒引起的不可预知的传染病危机频发,造成了严重的公共卫生问题。甲型流感病毒(IAV)引发的大流行,如1968年的香港流感(H3N2)和2009年的猪流感(H1N1),给公众健康带来了巨大冲击。最近爆发的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)更是造成了全球性的灾难,导致1490万人死亡。专家普遍认为,下一轮大流行很可能会由人畜共患病导致,考虑到历史先例以及60.3%的新发传染病源自动物宿主。IAV尤其具有较高的大流行风险,因为它能感染多种宿主并发生抗原性漂移。因此,及时准确诊断IAV感染对于有效管控疫情、减少传播、预防大流行至关重要。

目前,实时定量PCR(RT-qPCR)被视为现有诊断工具中的金标准,在历次大流行中发挥了关键作用,凭借其高准确性和灵敏度。但RT-qPCR需要专业人员操作,且需要大量时间,不太适合那些需要快速诊断和立即隔离感染者的场景,以阻止进一步感染。因此,迫切需要开发快速简单的现场检测(POCT)解决方案,来克服现有技术的局限性,实现及时决策隔离和治疗。

针对这一需求，作者开发了一种基于生物素化金纳米颗粒(BGNPs)的超敏感比色免疫检测系统。该系统采用了两步信号放大机制:首先利用亲和素-生物素的强作用力,实现BGNPs在靶标周围的层层堆积,大幅提升检测信号;其次利用BGNPs的酶样活性,进一步放大靶标特异性的检测信号。这种双重放大策略,结合对GNPs表面性质的精确控制、靶标特异性放大以及酶样效应,使得该检测系统能在短短55分钟内实现目标病毒的可视化超高灵敏检测。

与现有技术相比,该诊断系统不需要病毒裂解预处理,能直接检测完整病毒颗粒,从而避免由残留核酸引起的假阳性,提高诊断的准确性和可靠性。总之,这种基于双重信号放大的免疫检测具有超高灵敏度和选择性,为现场病毒检测提供了一种先进、可靠的解决方案。

2. 结果与讨论

2.1. 基于BGNPs的层层信号放大机理

该检测系统的工作原理如Scheme 1所示,主要包括三个步骤:

靶标病毒的捕获：含生物素的多克隆抗体与靶标病毒形成夹心复合物,并通过亲和素-生物素作用桥接在包被有单克隆捕获抗体的板面上。

BGNPs的层层堆积：亲和素先与生物素结合,然后吸附BGNPs,形成层层累积的结构,增强了检测信号。每循环一次亲和素和BGNPs的添加,放大信号的程度都会有所提高。堆积的BGNPs呈现出肉眼可见的红色信号,与病毒滴度呈现剂量-响应关系。

BGNPs的酶样活性：堆积的BGNPs具有过氧化物酶样活性,能够催化无色的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)氧化为蓝色。这一步进一步放大了检测信号,使其呈现蓝绿色。

整个检测过程用时55分钟,结合了靶标捕获、BGNPs层层堆积和酶样信号放大三个步骤,最终生成可见的颜色信号,既可用肉眼观察,也可进行定量测定。这种双重放大策略大幅提升了检测的灵敏度和特异性。

2.2. BGNPs的酶样活性

为了实现有效的信号放大和灵敏病毒检测,我们仔细研究了BGNPs的表面性质,包括其亲和素辅助的层层堆积效应和酶样活性。

通过将生物素PEG颜料(SH-PEG-生物素)修饰在GNPs表面,赋予其过氧化物酶样性质,能够在加入H2O2和TMB时引发TMB的氧化。适当的生物素修饰对于层层堆积放大至关重要,但过度修饰可能会遮蔽GNPs表面,影响其酶样活性。

经过优化,作者发现直径12nm的GNPs显示出最佳的TMB氧化效率,而gold:PEG-生物素质量比为1:0.1的BGNPs表现出最高的酶样活性。进一步研究发现,BGNPs在同时存在H2O2和TMB的条件下才能产生强烈的652nm吸收峰,表明其特异性催化TMB氧化的酶样特性。通过分析BGNPs浓度与吸光度的线性关系,证实了堆积的BGNPs数量与检测信号的正相关性,为后续的放大检测奠定了基础。

2.3. 亲和素包被板面上的双重放大评估

在确定了BGNPs最佳的酶样活性条件后,我们探索了通过有效的BGNPs层层堆积来放大检测信号的策略。聚乙二醇(PEG)链长及其接枝密度是影响堆积过程中的位阻效应的关键因素。

合成了不同分子量(0.4, 1, 3.4, 5 kDa)的SH-PEG-生物素修饰的BGNPs,并通过热重分析研究了其表面接枝密度。结果显示,随着PEG链长的增加,接枝密度呈下降趋势,这归因于较长PEG链的构象熵增加。亲和素-BGNPs的结合过程受到表面位阻的显著影响,因此我们选择了PEG分子量为1 kDa的BGNPs进行后续实验,以实现最佳的堆积放大效果。

在亲和素包被的板面上,系统评估了BGNPs的两步放大策略。首先通过亲和素-生物素作用,BGNPs在靶标周围层层堆积,大幅提升了检测信号强度。其次利用BGNPs的酶样活性,催化TMB氧化产生蓝绿色信号,进一步放大了检测效果。结果表明,这种双重放大机制能够在短时间内(55min)实现病毒的超高灵敏可视化检测。

3. 结论

本文提出了一种基于BGNPs的创新性超敏感比色免疫检测系统,实现了对甲型流感病毒(IAV)的快速可视化检测。该系统巧妙结合了靶标特异性捕获、BGNPs的层层堆积增强信号、以及BGNPs酶样活性进一步放大等关键技术,在55分钟内即可完成检测。

与现有商用快速检测和传统ELISA相比,该系统检出限提高2500倍,达到101.29 EID50 mL^-1的超高灵敏度。此外,该系统还具有抗干扰能力强、便携性好等优点,为现场病毒检测提供了一种先进、可靠的解决方案。未来该技术有望应用于针对各类呼吸道病毒的快速诊断,为疫情防控提供有力支撑。

参考文献

Jeong, E., Park, G., Kim, J., Lee, S., Park, C., Lim, J.-W., Yeom, M., Song, D. and Haam, S. (2024), Ultrasensitive and Visible Detection of Influenza A Virus Based on Enzymatic Properties of Layered Gold Nanoparticles. Small Struct., 5: 2300380. https://doi.org/10.1002/sstr.202300380