酶加速催化 DNA 电路能够快速、一锅法检测病原菌

食源性致病菌感染对全球公共卫生构成严重威胁，及时识别病原菌对于防止食物中毒和控制疾病进展至关重要。目前，传统的细菌检测方法如平板培养和聚合酶链反应（PCR）存在一定的局限性，尤其是在检测速度和便捷性方面。平板培养需要较长时间且操作繁琐，而PCR方法则要求多步实验过程，包括样本预处理、核酸提取及扩增，且需要昂贵的设备。近年来，质谱和16S rRNA基因测序等技术被提出作为替代方案，但其高成本和复杂工作流程仍然限制了其应用。因此，开发一种简单、快速、经济且能够在复杂基质（如食品、血液、粪便等）中进行高灵敏、直接细菌检测的方法显得尤为重要。

Figure 1 传统催化发夹组装（CHA）和构建的酶加速CHA（EACHA）示意图（上）。EACHA系统的详细反应过程（下）。蓝色和黑色小颗粒分别表示荧光团FAM和淬灭剂BHQ1。

催化DNA电路作为一种信号放大技术，已被广泛用于生物标志物的检测，其中催化发夹组装（CHA）和杂交链反应（HCR）是常见的策略。然而，传统催化DNA电路存在反应深度低和反应动力学缓慢等问题，导致反应时间过长，灵敏度和检测性能较差。为解决这些问题，研究者们提出了多种改进策略，如通过自反馈自催化机制提高反应深度，或者通过引入聚合物和空间限制结构来加速反应过程。然而，这些方法往往需要复杂的设计，且在某些情况下可能会引起非特异性相互作用，导致信号泄漏。在此背景下，基于核糖核酸酶H（RNase H）辅助的催化发夹组装（EACHA）方法应运而生。这种方法通过RNase H的消化作用，将传统CHA中的双链产物转化为发夹反应物，这些反应物可以自供给并参与下一轮反应，从而显著提高反应速率和深度。EACHA方法不仅缩短了检测时间，还提升了检测的灵敏度（图1）。此外，研究者们进一步发展了全酶促探针触发的EACHA（AP-EACHA）策略，这使得方法在不需要培养和核酸提取的情况下，在短短20分钟内即可实现对肠炎沙门氏菌等致病菌的快速、直接检测。该方法已成功应用于牛奶、血清和粪便中的细菌检测，能够高效、准确地识别污染样品，为食品安全和疾病防控提供了快速可靠的检测手段

Figure 2 评估AP-EACHA在小鼠沙门氏菌（S. Enteritidis）感染诊断中的应用。(A) AP-EACHA检测小鼠粪便和血清样本中沙门氏菌的示意图。(B) 和 (C) 分别显示了在特定时间点检测的小鼠粪便和血清样本中沙门氏菌的荧光信号（配对样本t检验，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）。(D) 和 (E) 分别展示了对小鼠粪便和血清样本的ROC分析，用于区分早期（2至6小时）和晚期（12小时至5天）感染的沙门氏菌与健康小鼠。AP-EACHA：全变构探针触发的酶加速催化发夹组装；ROC：受试者工作特征分析。

EACHA 系统是对传统催化发夹组装（CHA）方法的改进版，采用了在发夹环区引入 RNA 代替 DNA，并加入了 RNase H 酶，以提高反应动力学和灵敏度。该系统通过促进发夹结构的连续回收，RNase H 消化发夹复合物中的 RNA 序列，使 H1 可以参与后续反应，从而快速放大荧光信号。实验结果证明，与传统的 CHA 方法相比，EACHA 显著提高了反应速率和信号放大。实时荧光分析表明，EACHA 能更快产生荧光信号，且荧光强度更高，这归因于引物和发夹结构的回收。EACHA 的反应速率常数比 CHA 高出约 37.6 倍，显示出更快的动力学。EACHA 的灵敏度也优于传统方法，能够检测低至 1 pM 的引物 P 浓度，比 CHA 灵敏度提高了 100 倍。该系统能够在 1 pM 到 20 nM 的广泛范围内检测引物，适用于高灵敏度的生物传感应用。通过优化系统中的酶与底物的比率和反应条件，EACHA 成功实现了对沙门氏菌 Enteritidis（S. Enteritidis）的快速、特异性检测。通过使用针对 S. Enteritidis 的变构探针（AP），系统可以选择性地触发 EACHA 反应，在 20 分钟内产生强烈的荧光信号。AP-EACHA 方法对 S. Enteritidis 显示出极高的灵敏度和特异性，能够检测最低 15 CFU/mL 的浓度，比 RT-PCR 更灵敏，RT-PCR 的最低检测限为 200 CFU/mL。该方法在复杂样品（如血清、牛奶和水）中同样表现出色，且能够有效地识别受污染的食品。在小鼠临床样本中的诊断表现也十分出色，早期和晚期感染的灵敏度分别达到 100% 和 94.1%，特异性分别为 92.6% 和 89.7%。总的来说，AP-EACHA 系统提供了一种简单、快速且灵敏的工具，能够用于沙门氏菌等细菌感染的检测，具有食品安全和临床诊断中的应用潜力。图2A展示了AP-EACHA 检测小鼠粪便和血清样本中的 S. Enteritidis的流程。

总的来说，本研究开发了一个具有高反应速率的 EACHA 系统，通过结合变构探针（AP），实现了在复杂基质中对肠炎沙门氏菌的快速、一锅式检测。与其他催化 DNA 电路相比，EACHA 系统通过最小化发夹反应物，避免了多个 DNA 链和复杂序列设计的需求，从而实现了高灵敏快速检测。此外，AP-EACHA 方法在 20 分钟内能够特异地识别牛奶、血清和粪便中的肠炎沙门氏菌，并且无需复杂的样品准备、细菌培养或核酸提取，为病原检测提供一种有前景的工具。

原文：doi：https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-4595145/v1