昆虫细胞革命：如何通过实验室进化提升重组蛋白产量

适应性实验室进化技术（Adaptive Laboratory Evolution, ALE）是一种培养细胞以适应非典型细胞培养条件的方法，这些条件可能涉及温度、pH水平或溶解氧（DO）水平等参数。这项技术涉及在特定的选择性压力环境中对细胞进行连续的传代培养（参考图1）。在这个适应性发展的过程中，通常能够筛选出对特定生产过程具有更强适应性的细胞群体，比如在重组蛋白生产领域。作为一种强化工具，ALE能够提升细胞系在特定应用中的适应性，特别是在重组蛋白的生产领域。通过适应非标准培养环境，细胞能够发展出特定的特性，使它们成为高效的生产者。尽管ALE已被广泛应用于微生物培养，并且在哺乳动物细胞培养中也有所应用，但其在昆虫细胞培养中的应用还相对较少。

图 1 适应性实验室进化 （ALE） 方案

Ricardo Correia等人经研究后描述了一种通过ALE方法使昆虫High Five和Sf9细胞适应非标准培养条件的方法，并用两个案例向我们展示了ALE通过操纵不同的培养条件，增强不同昆虫细胞宿主和表达系统中的生产力潜力。

① 首先研究者将昆虫High Five细胞从标准pH（6.2）适应到中性pH（7.0）环境；这种适应使得使用瞬时杆状病毒表达载体系统生产流感病毒样颗粒（VLPs）的能力提高了三倍。

② 其次，研究者将昆虫Sf9细胞从标准培养温度（27°C）适应到低温生长（22°C）环境，这种适应使得使用稳定细胞系生产流感VLPs的能力提高了六倍。

建立适应非典型细胞培养条件细胞群体的方法步骤

1. 昆虫细胞的解冻和培养

将细胞悬液加入到细胞培养的摇瓶中并添加必要的培养基体积，混合均匀，放置在27°C的摇动培养箱中，并取至少0.5mL的样本进行细胞计数。当细胞浓度达到2-4×10⁶cell/mL时，每2-3天传代一次，通过将细胞稀释到新培养基中的目标浓度0.3-0.5×10⁶cell/mL（High Five细胞）或0.6-1.0×10⁶cell/mL（Sf9细胞）。当连续至少三个传代达到恒定的细胞增长率时，可以开始将细胞适应到非标准培养条件。

2. 昆虫细胞的适应性实验室进化实验步骤

直接将细胞从标准培养参数适应到目标值可能会对细胞生长和活性产生负面影响，在这种情况下，建议采取逐步的方法，以最小化任何不利影响。

A. 准备适当的培养设置，以适应细胞到非标准培养条件：

(a) 如果这些条件是通过改变培养基（例如，pH值、渗透压）提供的，那么准备相应的适应性培养基。

(b) 如果这些条件是通过改变培养参数（例如温度、DO）提供的，那么确保培养设备支持这些条件。

B. 将细胞传代到非标准培养条件中：

(a) 如果这些条件是通过改变培养基提供的，那么使用适应性培养基而不是Insect-XPRESS™或Sf-900 II进行细胞传代。

(b) 如果这些条件是通过改变培养参数提供的，那么在相应的设备中改变该参数的设定点，并使用标准昆虫细胞培养基进行细胞传代。

C. 在改变培养条件后，每天监测细胞浓度和细胞活性。

D. 根据标准培养条件下用于传代细胞的细胞浓度标准，将细胞传代到非标准条件中。

E. 继续传代细胞，直到至少连续三个传代达到恒定的细胞增长率。

F. 建立这种新适应的细胞系的主细胞库（Master Cell Bank，MCB）。为此，将所需数量的细胞转移到无菌管中，以200×g的速度在4°C下离心10分钟，丢弃废培养基，并将细胞重悬在所需的CryoStor® CS10细胞冷冻介质体积中。然后，将细胞悬浮液分配到冷冻管中，使用CoolCell®容器在-80°C下冷冻细胞，最后将管转移到液氮储存中。

G. 如果目前使用的非标准培养条件是适应过程的一个中间阶段，那么继续通过改变培养参数到下一个值进行适应过程，并重复以上步骤。如果目前使用的非标准培养条件是操作者希望细胞适应的目标条件，那么新生成的适应昆虫细胞系可以用于重组蛋白生产。

3. 提高通过ALE的昆虫High Five细胞到中性pH的流感VLPs生产

Correia等人通过昆虫细胞的适应性实验室进化实验步骤，将昆虫High Five细胞通过逐步方法（适应pH 6.5、6.8，最后是7.0）从标准pH值≈6.2适应到pH 7.0的培养基培养。然后，这些适应的细胞被用于使用IC-BEVS生产显示血凝素的流感VLPs，并且与在标准条件下培养的非适应昆虫High Five细胞获得的生产率进行了对比。这种适应策略使得流感VLPs的生产提高了三倍（图2）。使用血凝素测定（HA测定）评估每个生产运行的HA滴度。

图 2 pH变化和细胞适应性进化对流感VLPs生产的影响。

图2说明：条形图表示在中性pH培养基（CMpH7）或标准InsectXPRESS™培养基中pH 6.2（CMpH6.2）中适应和非适应细胞的特定HA生产率。

4. 提高通过ALE的昆虫Sf9细胞到低温生长的流感VLPs生产

在标准温度27°C下培养的稳定昆虫Sf9细胞，表达显示血凝素的流感VLPs，通过一步法直接从27°C适应到22°C将细胞适应到低温生长。细胞在重复批处理模式下培养超过40代，直到不再观察到细胞增长率的增加。然后，这些适应的细胞被用于表达流感VLPs，并且与在标准条件下培养的非适应稳定昆虫Sf9细胞获得的生产率进行了对比。这种适应策略使得流感VLPs的生产提高了六倍（图3）。

图 3 培养温度变化和细胞适应性进化对流感VLPs生产的影响

图3说明： 灰色条形图对应于在27°C下培养的非适应Sf9细胞。橙色条形图对应于在22°C下培养的适应Sf9细胞。

总结：

1. 研究者通过适应性实验室进化（ALE）描述了建立适应非标准培养条件的昆虫细胞群体的方法与案例。

2. 重组蛋白生产中的改进是依赖于细胞、产品和培养条件的。没有统一的公式能够确保提升所有目标重组蛋白的产量，同样，一种特定的细胞系和非标准培养条件的组合虽然可能对某一产品的表达有所提升，但这并不意味着它同样适用于提高另一种产品的生产效率。因此，研究人员只是向读者展示建立这些适应细胞群体的方法以供借鉴。

原文链接：https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-0716-3961-0_6