纳米孔对乙肝/丁肝病毒共感染的有效检测

乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV）与丁型肝炎病毒（Hepatitis D Virus, HDV）合并感染是人类病毒性肝炎中最严重的形式之一，较HBV单独感染更易加重患者发生肝硬化和肝细胞癌的风险。虽然HDV感染目前呈全球性流行，但迄今为止各国对丁肝病例统计数据存在较大差异，限制了丁肝流行病学信息的建立。HDV是一种缺陷型RNA病毒，其组装和传播只有在乙肝表面抗原（HBsAg）存在的情况下才会发生，因此临床上依赖于病毒表面抗原-抗体免疫反应的检测手段，常会忽视HDV/HBV共感染或是难以确定HDV的存在。而核酸检测方面，具有高GC比率的HDV RNA基因组由于倾向于折叠成复杂的次级结构，在提取过程中伴随着显著的损失和/或变性而影响PCR效率。因此，开发高效的HDV特异性抗原分子检测无疑成为HBV/HDV共感染诊断的关键。

中国科学院重庆研究院王亮团队于《Materials Today Physics》上发表了研究成果，建立了一种纳米孔生物单分子精准测量方法，可实现HDV病毒核心抗原的精准检测，在分子和细胞水平上特异、高效地检测不同类型肝炎病毒感染的生理指标，为更严重的HBV/HDV共感染的诊断和治疗提供了新的思路。

方案1 纳米孔识别HDV抗原并区分HDV/HBV感染的细胞

研究结果

1. HDAg蛋白的纳米孔鉴定

Ø HDV病毒基因组只编码一种核糖核蛋白—丁型肝炎抗原（HDAgs），该抗原以两种形式存在：S-HDAg（195个氨基酸）和L-HDAg（214个氨基酸），且序列相似度极高。

Ø HDAgs核心抗原参与了HDV病毒的复制、扩增、颗粒组装和传播，并且该蛋白不易变异，成为HDV检测的新标准。

Ø 在L-HDAg和S-HDAg鉴定中具有不同电流调制水平的读数准确度的显著差异。

Ø 将L-HDAg和S-HDAg混合同时鉴定，以评估纳米孔测量的准确性。，根据电流调制的独特特征和事件频率，可以准确地识别和量化由两种类型HDAg产生的电流水平的分离式波动。

图1 MspA 纳米孔中鉴定 L-HDAg 和 S-HDAg 蛋白。

注：（a）L-HDAg；（b）S-HDAg；（c）同时检测 L-HDAg 和 S-HDAg。 （i） 纳米孔测量 HDAgs 的示意图。（iii） ΔI/I_O vs. τ_off 散点图的相应统计分析。（d） ΔI/I_O、τ_off 和不同电流调制水平的事件频率比较。（ⅰ）ΔI/I_O；（ⅱ）τ_off；（ⅲ）事件频率。

2. 血清样品中HDAgs-Ribozyme复合物的纳米孔鉴定

Ø 准双链HDV RNA基因组（也称为核糖酶Ribozyme）与HDAgs通过特定的分子亲和力密切结合，形成稳定的蛋白-RNA复合体，在二价金属离子催化下，通过自切割活性在病毒滚环复制过程中产生单位长度的病毒分子。

Ø 通过模拟揭示HDAgs大小抗原以及MspA纳米孔的三维结构特点，结合不对称离子液体系对纳米孔电学检测的调控、基于Ribozyme保守序列的核酸适配体探针的优化设计，研究有效提升了纳米孔与HDAgs核心抗原之间的特异性相互作用，实现了血清中不依赖于抗体-表面抗原反应的S-HDAg、L-HDAg和HDAgs-RNA复合体的有效检测。

Ø 根据纳米孔测量的典型电流轨迹和相应统计分析的结果，可以将被MspA纳米孔捕获的RNA、L-HDAgs-Ribozyme和S-HDAgs-Ribozyme复合物的电流幅度彼此区分开。

Ø HDAgs-Ribozyme可以通过设计的磁捕获和热释放方法在血清样品中有效地检测，血清中类似的永久性阻塞也并不影响。

Ø 纳米孔传感器可在超低浓度下检测到HDAgs-Ribozyme提取物，与直接血清检测L-HDAg和S-HDAg相比灵敏度提高。

图2 血清中 HDAgs 和HDAgs-ribozyme的纳米孔检测

（a）利用病毒核酶的高保守序列指定 RNA 合道体，然后对血清样品中的 L-HDAg 和 S-HDAg 进行磁捕获和热释放的示意图。具有代表性的纳米孔检测轨迹和相应的永久阻塞直方图：（b）纯 HDAgs-Ribozyme复合物；（c）血清样品；（d）通过磁捕获和热释放从血清中提取 HDAgs-Ribozyme；（e）血清和HDAgs-Ribozyme复合物之间 ΔI/I_O 的显著差异分析；（f）纯 HDAgs-Ribozyme复合物与从血清中提取的 HDAgs-Ribozyme复合物 ΔI/I_O 的显著差异分析。（g） HDAgs-Ribozyme复合物的定量分析，通过磁捕获和从血清中热释放提高了检测灵敏度。

3. 纳米孔对HBV和HDV共感染细胞的鉴定

Ø 基于对重组HDV和HBV抗原构建的病毒感染Huh7细胞系（人类血色素细胞），研究通过裂解物测定和抗原分析，能够成功区分鉴定丁肝核心抗原（HDAgs）和乙肝表面抗原（HBsAg），所提出的纳米孔方法可以实现对HBV和HDV共感染细胞的鉴定。

图3 纳米孔对HBV和HDV共感染细胞的鉴定

（a）利用 Huh7-NTCP 细胞系构建 HBV 和 HDV 感染细胞的示意图。纳米孔检测的代表性电流轨迹以及相应的 ΔI/I_O 和 τ_off 统计分布（b）未感染细胞；（c）HBV 感染细胞；（d）HDV 感染细胞。

创新点

本文在分子和细胞水平上实现对不同肝炎病毒感染的特异性和高效检测，解决了传统方法中依赖于表面抗原-抗体反应对HDV难以识别的问题，研究对不同肝炎病毒合并感染的诊断、治疗以及HDV流行病学信息的建立有一定的指导意义。