Nature | 细菌“不死”之谜：揭秘细菌持久性细胞的存活策略

在抗生素的狂轰滥炸下，有些细菌却还能“死里逃生”。这些“打不死”的小强就是所谓的持久性性细胞。它们通常处于一种休眠或生长停滞状态，能在恶劣环境中存活下来。这些细菌是如何做到的？它们的生存策略又是什么呢？

最近，哥伦比亚大学生物科学系Saeed Tavazoie团队发表在Nature杂志上的一项研究Identification and genetic dissection of convergent persister cell states，揭示了细菌持久体（persister cells）的生存秘籍。研究者发现这些细菌通过一种特殊的生存状态来逃避抗生素的攻击。他们利用单细胞RNA测序技术（scRNA-seq），描述了大肠杆菌中持久性细胞的形成和维持。通过CRISPR干扰筛选，研究团队鉴定了影响持久体性细胞的关键基因。

研究内容

1.不同的持久性状态

研究团队首先关注了一种名为 metG* 的超持久态突变体，该突变体在甲硫氨酸tRNA连接酶基因中有一个12bp的缺失。通过在恒化器中培养超过12小时，研究者们建立了一个均匀的指数生长群体。在指数生长期，无论是 metG* 还是野生型（MG1655）细胞，经过氨苄青霉素或环丙沙星处理后，存活率都低于0.01%。然而，当细胞进入静止期时，metG* 细胞显示出显著的延迟期持久态，存活率在几分钟内增加了100倍，最终稳定在30-60%。而野生型细胞的存活率仅达到0.01-0.02%。同时，metG细胞的菌落出现时间（作为滞后时间的代理）变长，而野生型细胞则没有。研究人员使用PETRI-seq技术在关键时间点对大肠杆菌细胞进行单细胞RNA测序，并利用UMAP技术进行可视化。他们发现，在metG细胞变得超持久之前，这些细胞与野生型细胞在UMAP上的分布相似。随着存活率的增加，metG细胞的转录组出现双峰分布，其中一个群体与野生型相似，另一个则不同，被认为是持久性细胞。这些持久性细胞的mRNA丰度较低，与静止期细胞相似。

图1：揭示大肠杆菌生长阶段的单细胞RNA图谱和独特持久态细胞群

2.持久性细胞转录组集群

研究人员发现，经过氨苄青霉素处理的metG细胞显示出持久性细胞状态，且这种状态在不同遗传背景下的持久性细胞中是相似的。无论是hipA7突变体还是饥饿处理的野生型细胞，都显示出与metG细胞相同的持久者细胞状态。此外，研究人员还发现，使用抗生素四环素处理的细胞也表现出持久者细胞状态，这进一步支持了翻译缺陷是持久性状态的一个关键特征。这些结果表明，尽管不同模型中持久者细胞的基因表达存在差异，但它们都共享相似的转录组特征，即翻译活动的减少。这一发现对于理解细菌持久性的本质和开发新的抗生素策略具有重要意义。

图 2：持久性细胞转录组集合表明翻译缺陷是持久转录组的一个定义特征

3. 低转换是持久化性状态的基础

由于缺乏明显上调的已知通路来定义持久性细胞状态，研究人员采用了替代方法来理解这一转录特征。他们发现metG*和hipA7突变与翻译过程相关，因此使用抑制翻译的抗生素四环素处理野生型细胞。结果表明，四环素处理的细胞与持久性细胞聚集在一起，这暗示翻译缺陷可能是持久性转录组的一个关键特征。通过大量蛋白质组学分析，研究人员发现持久性细胞的蛋白质组与静止相的变化不大，尽管转录组对新鲜培养基有反应。进一步的分析显示，持久性细胞中存在活性转录，而四环素处理的细胞则表现出较低的mRNA计数，这表明翻译缺陷足以解释持久性细胞中较低的转录本计数。

研究人员还探讨了自我维持的持久性细胞与四环素诱导的耐受细胞之间差异表达的基因，这些基因可能对持久性的形成和维持至关重要。他们发现，与四环素处理的细胞相比，metG*、hipA7和6天野生型持久性细胞中上调的基因有显著重叠。这些基因的上调可能表明对tRNA氨酰化破坏的代偿反应。此外，持久性细胞中还上调了蛋白质代谢、氨基酸生物合成和三羧酸循环等途径，而四环素处理的细胞则表达了更多的核糖体成分，这与持久性细胞相比，表明下游翻译抑制。

图 3：翻译抑制作为预测持久性因果关系途径的参考。

4. 用于识别持久性驱动程序的 CRISPRi

在确定了与持久性相关的表达模式通路之后，研究人员进行了全基因组CRISPRi筛选，以识别与持久性形成和维持相关的基因和通路。他们使用CRISPR适应介导的文库制造（CALM）技术生成了覆盖所有大肠杆菌基因的CRISPR RNA（crRNA），并利用CRISPRi技术探测每个基因对不同遗传背景下细胞的滞后期和抗生素存活的影响。研究发现，某些基因的敲低能够显著缩短滞后时间，特别是对于metG突变体，敲低lon和yqgE基因显著缩短了滞后时间，并且这些基因在持久性细胞中的表达量显著上调。此外，CRISPRi筛选结果与scRNA-seq数据相吻合，证实了这些基因在持久性中的作用。研究人员还发现，TCA循环相关基因的敲低能够缩短滞后时间，而某些基因型特异性的通路，如蛋白质代谢基因，对metG滞后时间有显著影响。

图 4：全基因组 CRISPRi 筛选揭示了导致滞后依赖性持久性的基因和通路。

5. metG* 超持久性中的 lon 和 yqgE

研究metG持久性的7个主要驱动因素中，lon、yqgE和priA基因被选中进行基因组缺失验证。研究发现，lon和yqgE基因的缺失显著降低了metG的滞后依赖性持久性，而priA基因的缺失则没有影响。Lon蛋白酶与持久性有关，其缺失降低了抗生素存活率，且这一作用不依赖于SulA。YqgE基因的缺失降低了metG*细胞的抗生素存活率，并缩短了滞后时间，可能通过抑制蛋白质表达来促进细胞休眠。Lon蛋白酶可被小分子硼替佐米药理学抑制，这可能为抗生素佐剂提供新方向。YqgE在促进细胞休眠中起作用，其活性在固定期早期最重要，且在野生型细胞中过表达yqgE可以增加滞后时间和抗生素存活率。CRISPRi筛选显示，lon和rpoH是逆转YqgE促进的休眠的热门命中。YqgE可能抑制蛋白质表达，这对于延长饥饿后的滞后时间至关重要。在多个物种中，yqgE同源物的存在支持YqgE样蛋白在变形菌门中的全局调节作用。

图 5： Lon 蛋白酶和 YqgE 在滞后依赖性超持久性中起关键作用。

参考文献：

Blattman, S.B., Jiang, W., McGarrigle, E.R. et al. Identification and genetic dissection of convergent persister cell states. Nature (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-08124