杆状病毒是一类大型病毒，以其双链DNA基因组而著称，它们主要感染节肢动物，特别是昆虫。由于这种病毒对特定昆虫种类具有高度的专一性，并且对环境友好，因此它们在农业害虫控制领域被广泛研究，作为一种潜在的微生物杀虫剂。在这些研究中，家蚕草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）尤其受到关注，因为它是一种重要的农业害虫。从这种害虫中衍生出的Sf9细胞系，已成为研究杆状病毒与昆虫相互作用的重要模型。特别是，科研人员对AcMNPV（Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus）进行了深入研究，这是一种属于杆状病毒科的核多角体病毒，它在家蚕草地贪夜蛾Sf9细胞中的感染机制对于理解其作为杀虫剂的潜力至关重要。

杆状病毒影响宿主基因的感染机制大多未被明确，但microRNA（miRNA）已成为潜在的转录后调控分子，microRNA是一类小的非编码RNA分子，它们能够调节宿主细胞中超过60%的基因，在转录后调控基因表达中起着关键作用。miRNA通过与靶mRNA的互补配对来抑制基因表达，从而在多种生物学过程中发挥作用，包括发育、免疫反应、细胞凋亡以及宿主与微生物的相互作用。有报道称，家蚕NPV编码的miRNA通过与Exportin-5共因子Ran相互作用，阻碍宿主miRNA生物合成。相同地，研究者团队也报道了AcMNPV感染主要导致细胞miRNA的整体抑制，发现S. frugiperda中大多数miRNA的表达水平在AcMNPV感染后发生变化，大多数被下调，这加强了细胞miRNA参与杆状病毒-昆虫宿主相互作用的假设。

在这篇文章中，Maryam Ghadimmollaloo等人探讨了Sfr-miR-184这一特定的家蚕miRNA在AcMNPV感染后的变化，以及这种变化如何影响宿主细胞与病毒之间的相互作用。

涉及到的实验方法：

1. 家蚕Spodoptera frugiperda细胞系（Sf9）培养和AcMNPV病毒感染；

2. NCBI上对Sfr-miR-184同源的潜在靶标的筛选以及研究；

3. Sfr-miR-184靶标蛋白Prohibitin电泳和Western蛋白免疫印迹；

4. 用特异性引物对AcMNPV基因组中的ie-1进行定量PCR（qPCR）；

5. 从AcMNPV感染的Sf9细胞中提取总RNA，对特定miRNA序列Northern分子印迹杂交；

6. RT-qPCR和miRNA模拟物及抑制剂在Sf9细胞系中进行转染应用；

7. Sf9细胞体外诱导RNA沉默；

8. 抗体介导的AcMNPV感染抑制测定

实验结果：

图 1 AcMNPV感染后Sfr-miR-184的表达差异

如图1，通过微阵列分析，研究者发现与模拟感染的细胞相比，AcMNPV感染后Sfr-miR-184的整体水平逐渐下降（图1A）。为了探究Sfr-miR-184在AcMNPV感染后下调是否是由于病毒复制或进入，AcMNPV病毒颗粒通过紫外线辐射灭活后用于感染Sf9细胞。结果表明，接种灭活病毒时Sfr-miR-184浓度没有明显变化（图1B），这表明该miRNA下调与病毒复制有关。

研究者们运用了多种工具来预测Sfr-miR-184的潜在靶基因，并在NCBI的家蚕核苷酸数据库中发现了Prohibitin基因的编码区域内存在靶位点。他们进一步分析了Sf9细胞在AcMNPV感染后Prohibitin基因表达的变化，发现在未感染的细胞中Prohibitin的表达水平较低，而病毒感染后其表达水平显著上升，这与Sfr-miR-184表达水平的下降趋势相吻合。这一发现促使研究者们提出了Sfr-miR-184可能对其靶基因转录本进行负向调控的假设。通过将合成的Sfr-miR-184模拟物和抑制剂与相应的对照模拟物和抑制剂（具有随机序列）共转染入Sf9细胞，并通过Western印迹分析，研究团队验证了这一假设。

图 2 不同处理条件下Sf9细胞中GFP的表达量

图片说明：Sf9细胞被转染pIZ/GFP-Prohibitin（GFP/Prohibitin）或与pIZ/GFP-Prohibitin共转染的对照模拟物（C mimic）、对照抑制剂（C inhibitor）、Sfr-miR-184模拟物（184 mimic）和Sfr-miR-184抑制剂（184 inhibitor）后GFP的表达量。

为了进一步确认Sfr-miR-184与Prohibitin之间的相互作用，研究人员采用了基于GFP的报告系统在家蚕Sf9细胞中进行实验。他们将含有与Sfr-miR-184互补序列的Prohibitin基因片段克隆到GFP报告基因的下游，构建了pIZ/GFP-Prohibitin载体。该载体与Sfr-miR-184模拟物、抑制剂及对照寡核苷酸一起共转染入Sf9细胞。实验结果如图2所示，转染Sfr-miR-184抑制剂的细胞中GFP转录本水平显著升高，证实了Prohibitin基因的上调；而在Sfr-miR-184模拟物存在的条件下，GFP转录本水平降低，显示了下调效应。在对照抑制剂和模拟物转染的细胞以及仅转染pIZGFP-Prohibitin的细胞中，GFP转录本水平相似，从而证实了Sfr-miR-184对Prohibitin的负向调控作用。

在确定了Prohibitin作为Sfr-miR-184的靶基因后，研究人员进一步探究了Prohibitin在家蚕-病毒相互作用中的潜在作用。他们通过体外合成长dsRNA来沉默Sf9细胞中的Prohibitin基因，发现Prohibitin基因的沉默导致AcMNPV复制显著减少，这表明Prohibitin可能增强了AcMNPV在家蚕细胞中的感染。

总结：

1. Sfr-miR-184在AcMNPV感染的Sf9细胞中被下调，而紫外线灭活的病毒不会引起这种下调，表明这种miRNA的变化与病毒的复制有关。

2. Prohibitin基因被确定为Sfr-miR-184的靶标，其在AcMNPV感染后表达上调。

3. 通过合成miRNA模拟物和抑制剂的实验，证实了Sfr-miR-184对Prohibitin基因表达的负向调节作用。

4. Prohibitin在病毒-宿主相互作用中可能发挥作用，因为它的沉默或抗体介导的抑制可以显著减少AcMNPV的复制。

这些发现揭示了杆状病毒可能采用的新的分子策略来操纵宿主细胞，以利于其复制。通过揭示这些相互作用的分子机制，在为害虫控制策略提供新的见解，并可能为开发新的抗病毒方法提供科学依据。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.pestbp.2024.106032