利用肼化学辅助双识别CRISPR/Cas12a系统模块化检测金黄色葡萄球菌

Figure 1：用于检测 SA 的 DR-CRISPR/Cas12a 模块示意图

金黄色葡萄球菌（SA）是一种广泛存在于环境中的重要病原菌，可引发化脓感染、肺炎以及败血症等全身性感染，同时其产生的肠毒素还会导致食源性疾病，严重威胁公共健康和食品安全。传统检测方法如微生物培养、荧光原位杂交及PCR虽被广泛应用，但其耗时长、操作复杂且依赖专业设备和技术，限制了其在快速检测中的应用。为解决这些问题，亟需开发一种简单、高效、灵敏的检测方法。本研究创新性地构建了基于双识别CRISPR/Cas12a（DR-CRISPR/Cas12a）的模块化检测系统。通过引入肼化学，将分裂激活链分别修饰为带有肼基和醛基的两部分，并结合针对SA膜磷壁酸（LTA）和蛋白A（SPA）的特异性抗体，赋予系统双目标识别能力。双抗体同时识别SA外层的LTA和SPA抗原，使分裂激活链聚集并通过肼化学形成完整激活链，从而触发Cas12a的转切割活性，产生高灵敏度的荧光信号。该系统集成了分子识别和信号放大功能，可直接检测复杂基质中的活菌SA，并评估抑菌剂对其的抑制效果。实验表明，该方法灵敏度高、特异性强、操作简便，具有良好的稳定性和重现性，为细菌快速检测及抗菌药物评价提供了一种新型高效的工具。

Figure 2：Hydrazone 化学介导的 CRISPR/Cas12a 系统。（A） 腙化学介导的 CRISPR/Cas12a 系统的工作原理。（B） 聚丙烯酰胺凝胶电泳图像。（C） CRISPR/ /TS2-CHO 和 TS 的荧光光谱。（D） （1） TS1-NHNH2 和 （2） TS2-CHO 激活的具有不同碱基数的 Cas12a 2 的荧光光谱。（E） 获得 （1） 全长激活链 （TS） 和 （2） 整个激活链 （TS1- NHNH /TS2-CHO） 的 Michaelis-Menten 方程曲线。（F） （1） 全长激活链 （TS） 和 （2） 整个激活链 （TS1-NHNH 2 /TS2-CHO） 具有不同错配碱基数量（n = 3 个独立反应）获得的荧光强度。

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和傅里叶红外光谱（FTIR）表征，证实了肼键的成功形成及TS1-NHNH₂/TS2-CHO分裂链的制备。如图2显示，TS1-NHNH₂和TS2-CHO反应后形成的新条带迁移率减慢，与完整链TS一致，表明分裂链已组装成完整激活链。FTIR进一步确认肼键的特征吸收峰，表明反应的化学稳定性。对CRISPR/Cas12a的活化实验显示，单独存在TS1-NHNH₂或TS2-CHO时几乎无荧光信号，而在两者共同存在时产生高荧光信号，与完整链TS的效果相当，表明分裂链能够通过肼键重组并激活Cas12a系统。此外，实验优化了分裂链的碱基数目，发现10 nt是最佳长度，可确保特异性与灵敏度。比较完整链与分裂链的动力学参数（Km、kcat、kcat/Km），结果显示两者接近，表明肼键的引入对Cas12a活性无显著影响。同时，肼键的引入增强了对单碱基突变的识别能力，确保系统的高特异性。通过将分裂链修饰于羧基聚苯乙烯球（CPS）界面，研究了界面约束效应对CRISPR/Cas12a活性的增强。结果显示，在界面上，分裂链通过肼化学形成完整链后能够有效激活Cas12a，显著提高荧光信号。此外，界面支持系统的Km值显著降低，而kcat和kcat/Km值显著提高，表明其催化效率远高于溶液系统。这归因于crRNA/Cas12a在CPS界面的暂时聚集效应。

Figure 3：用于细菌分析的双重认可 CRISPR/Cas12a 系统的模块化。（A） 用于分析金黄色葡萄球菌的双重识别 CRISPR/Cas12a 系统模块化示意图。（B） 用于特异性识别金黄色葡萄球菌 SPAA-TS1 和 LTAA-TS2 的共聚焦图像。（C） 获得的金黄色葡萄球菌荧光光谱

通过将金黄色葡萄球菌蛋白A抗体（SPAA）和分裂激活链（TS1-NHNH₂）连接生成SPAA-TS1，同时将膜磷壁酸抗体（LTAA）与另一分裂激活链（TS2-CHO）连接生成LTAA-TS2，两者分别识别SA表面的蛋白A（SPA）和膜磷壁酸（LTA）。如图3当SPAA-TS1和LTAA-TS2同时结合SA表面靶标时，其肼基和醛基通过化学反应形成肼键，从而生成完整激活链，激活CRISPR/Cas12a系统的转切能力，切割荧光报告探针（BHQ1-ssDNA-FAM），产生荧光信号。实验通过荧光成像和光谱测试验证了分裂激活链与抗体的成功结合，优化了链长（30 nt）和浓度（12.5 µM）。在最佳条件下，该方法对SA的检测表现出良好的灵敏度和线性范围（50 CFU/mL至5×1065 \times 10^65×106 CFU/mL，R²=0.9976），检测限低至19.95 CFU/mL。特异性测试表明，该方法能有效区分金黄色葡萄球菌与其他革兰阳性和阴性菌种及真菌。此外，在实际样本（如患者滑液）中的应用结果与qPCR高度一致，显示出强大的实用潜力。通过对抑制剂氯原酸（CA）和刚果红（CR）的评估，发现CA能够显著抑制SPA和LTA的表达，而CR主要抑制LTA。联合使用两种抑制剂时，其对SPA和LTA的抑制效果更加显著。流式细胞术与该方法的对比表明，本方法对抑制剂作用的检测具有更高的灵敏度和特异性。

本研究提出了一种基于模块化双重识别CRISPR/Cas12a系统的新型检测方法，旨在提升CRISPR技术在诊断中的应用潜力。通过引入抗体-分裂激活链结合物与crRNA/Cas12a系统，利用双重识别实现对金黄色葡萄球菌（SA）的高效检测。该方法通过细菌表面空间限制引发的肼反应，加速了CRISPR/Cas12a系统的激活，成功实现了在30分钟内检测到19.95 CFU/mL的SA，且检测限低于之前的研究结果。方法具有高度的特异性，仅对SA敏感，且对其他革兰阳性细菌、革兰阴性细菌及真菌反应性较低。此外，这种方法在细胞裂解液和滑液样本等复杂样本中的应用表现出优异的分辨率，且其构建过程简便易行，与其他检测方法相比具有明显优势。最后，研究还展示了该方法在抑制剂效应评估中的应用，为其在环境监测、临床诊断和食品安全等领域的广泛应用奠定了基础。

原文doi：10.1016/j.jhazmat.2024.134877