用于微生物污染检测的芯片生物发光生物传感器

世界卫生组织表明，由病原微生物包括沙门氏菌属、李斯特菌属、梭状芽孢杆菌属和大肠杆菌属引起的污染是在全球范围内具有高住院率和死亡率的食源性疾病（FBD）爆发的主要常见原因，严重危险公众健康和生命。对此，微生物病原体的检测以及细菌表面微生物污染水平的评估对于食品安全以及监测实验室环境和卫生保健环境中的卫生至关重要。目前量化细菌表面微生物污染水平的方法有两种：一种是传统的表面污染评估方法，通常依赖环境擦拭技术，但是该技术需要经过较长的培养分离以及血清型分析时间，通常需要5-14天，较为耗时。另一种是较为有效和方便的检测技术：如免疫测定法、核酸分析、以及基于腺苷-5′-三磷酸（ATP）的化学发光分析，其中基于ATP的生物发光分析因其具有的灵敏度和准确度成为确保食品安全的重要工具。然而基于ATP的生物发光分析缺乏检测特异性，不能区分污染物类型和种类，即使加入纳米颗粒、引入ATP感应纸简化传感器部分改进其检测准确信、简便性和重复性，但其缺点也会造成该项技术无法普及和商业化应用。为了解决现有生物发光检测方法的不足，并最终促进食品安全，Reza Abbasi等人将注意力转向了接触模式、直接芯片上进行 CL 检测的、无透镜显微镜的传感器技术，并结合微流控系统和电化学发光（ECL）系统的集成，成功开发出紧凑型ECL生物传感器，其够在单一平台上同时处理样品和收集数据。与传统的化学发光检测设备相比，这些新型传感器平台在性能上有所提升，且具有较大的应用前景。同以往的研究相比，本次研究为了提高光子收集效率和灵敏度，同时保持生物传感设备的低成本和便携性，采用以下两种新的改进方案：

（1）通过移除传感器的红外滤光片和镜头，使样品到传感器表面的距离最小，提高光子收集效率。

（2）使用不透明的PDMS材料制造了样品架，通过切割压敏双面胶带以匹配微流控通道的尺寸，使用掩膜对准器(OAI Model 200)将不透明白色的PDMS器件精准对接到CMOS传感器。不透明的PDMS可以防止CL信号的反射，提高了信号与背景的比率。

图1：该图示为器件的制造和使用过程。研究通过去除原始镜头和红外滤光片来优化设计，从而减少样品与传感器表面之间的距离，提升了光子采集效率。为了防止光反射干扰并增强信噪比，使用不透明的PDMS材料制造了样品架，通过切割压敏双面胶带以匹配微流控通道的尺寸，使用掩膜对准器(OAI Model 200)将不透明白色的PDMS器件精准对接到CMOS传感器。在传感器的操作中，从表面污染物采集提取ATP与液态稳定试剂混合后，样品（10μL）被转移至CMOS图像传感器表面进行化学发光（CL）反应。反应后的CL信号在暗室内通过传感器进行测量。记录信号15 S(曝光时间)。结果随后在Raspberry PI触摸屏LCD上显示。较高的ATP浓度意味着更多的表面污染，并导致更强烈的CL排放。

为了评估CMOS传感器的性能，研究检测了该器件的灵敏度和检测限，分析比较了CMOS器件、发光计和平板阅读器在不同缓冲液（Invitgen Buffer和UltraSnap Buffer）中检测ATP的性能。随后，通过检查不同设备在UltraSnap缓冲液中分别检测1μM三磷酸腺苷的能力来研究制造过程的重现性和实用性。为了观测该传感器的效用，研究比较了该器件与商业发光计的性能，使用商业发光计和该传感器测量不同浓度的添加的ATP溶液。最后，采用实际样品进行检测，将CMOS传感器和EnSURE光度计均用于测量多种常见表面如电梯按钮、手机、快餐桌、钱包等的ATP污染情况。研究结果显示：

①该传感器的空间分辨率为1.4μm，图像传感器的视场为7.07 mm²，具备了较高的分辨率和光子收集能力；

②性能检测结果显示，ATP浓度的增加与CL信号的强度呈正相关，这说明该传感器能够有效评估污染程度。在UltraSnap 缓冲液中，这两种传感器的线性检测范围均为1至1000nM，在Invitrogen缓冲液中存在差异，CMOS传感器的线性检测范围为1000至200000nM，而光度计的检测范围为0至20000 nM。通过建立校准曲线计算两个设备的LOD，结果显示CMOS传感器的LOD为22.5 nM，EnSURE光度计的LOD为0.38 nM，尽管CMOS传感器的LOD较高，但其使用的样品体积（10 μL）远低于光度计所需的300 μL，这意味着CMOS传感器能够在较小的样本体积中获得相似的灵敏度。此外，CMOS 器件的检测限 (LOD) 为 225 fmol，与发光计的 LOD (115 fmol) 比较接近。

图2：图abcde为不同缓冲液中（Invitgen Buffer和UltraSnap Buffer）检测ATP的CMOS器件、发光计和平板阅读器的分析性能和比较。ATP浓度以对数标度表示，以覆盖整个浓度范围。插图中显示了试验所研究器件与其他两个设备类似的线性范围。

③通过对收集的化学发光强度进行分析得知，CMOS传感器在多个设备上收集的CL强度之间表现出良好的可重复性（RSD为9.20%)，利用CMOS传感器进行10次连续检测计算得到的RSD为8.25%，这一百分比证明了其在ATP的线性检测范围内具有良好的重现性。

图3：A)使用同一设备在UltraSnap缓冲液中演示10次测量(n=10)1μM ATP的生物传感器的重复性(n=10)；b)使用10种不同设备演示UltraSnap缓冲液中1μM ATP的10次测量(n=10)的生物传感器的重复性。

④该器件与商业发光计性能对比结果表明，用CMOS仪和Luminometer测得的三磷酸腺苷浓度与溶液中的实际浓度有很好的一致性。具体地说，y=x线的确定系数(R2)对于发光计是0.95，对于CMOS是0.98。

⑤实际样品检测的结果如图3所示：两个设备在污染趋势的检测上高度一致，且在相同的表面污染情况下，CMOS传感器的ATP浓度值普遍高于光度计，平均偏差约为40%。结合情况讨论，这种差异可能与样品准备过程中的细节差异有关，即CMOS设备是将样品直接放置在传感器表面，而光度计则使用了超声波管和试剂，部分样品可能在管壁吸附，导致测量误差。

图4：真实样品分析。使用 Hygiena UltraSnap 拭子进行采样。对相同的表面积进行 3 次 （a）、（b）和（c）采样，以使用光度计和 CMOS 测量 ATP。基于图3c和图3d中所示的用于发光计和CMOS 的校准曲线来确定恢复的ATP浓度。（d）显示了使用光度计和 CMOS 回收的浓度之间的比较，根据光度计值进行了归一化。

总体而言,该项研究开发的基于像素化CMOS图像传感器的新型ATP检测设备具有可靠的性能，展示出高达1μM的线性响应和225 fmol的检测限（LOD）。灵敏度上更是达到飞摩尔级别（与现有的光度计相当)，在多个设备之间表现出良好的可重复性（RSD为9.20%)。该设备同目前用于食品安全评估的商业化光度计检测能力相当且成本更低。更重要的是：该设备对样品和试剂的需求较低，有助于提高可接触性和成本效益。这些优势体现出该设备适用于食品安全等领域现场检测的巨大潜力。然而需要思考的是，该设备在区分污染物的种类以及区分细胞外ATP、死细胞、食物残渣等有机物和细胞内ATP之间仍然存在挑战。此外，现有的商业光度计和生物发光试剂盒相较于传统的培养方法价格较高，生物发光试剂的不稳定性和低光发射强度也需要不断改进，以提升检测的灵敏度和准确性。未来的一个研究趋势就是需要通过技术改进来解决这些关键问题。

DOI: 10.1016/j.bios.2024.116200