Science子刊：一滴血实验胰腺癌早筛，灵敏度高达85%

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来源：贺鹏霖

2025-02-21 09:56:57

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核心提示：美国俄勒冈健康与科学大学团队在《Science Translational Medicine》发表最新成果，开发了一种基于蛋白酶活性的血液检测技术——PAC-MANN，仅需8微升血液，即可在45分钟内完成检测！

　　胰腺导管腺癌(PDAC)是致死率最高的三大癌症之一，患者确诊时多为晚期，5年生存率仅3%。目前唯一获得FDA批准的PDAC肿瘤标志物CA 19-9在普通人群中的阳性预测值极低，仅为0.5-0.9%，不足以支撑其作为早期检测生物标志物。并且对于PDAC的筛查检测受到了多种因素的限制，比如样品的获取途径、检测成本、检测准确性等，故而亟需开发针对PDAC的特异性生物标志物的快速检测方法。在癌症的发展过程中，蛋白酶的激活促进了细胞外基质的降解，并且使得癌细胞得以入侵和扩散，故而蛋白酶作为基于血液的癌症诊断生物标志物具有较大的应用潜力。基于此，Montoya Mira等开发了一种名为PAC-MANN的检测方法：筛选得到了一种对于PDAC具有高区分度的探针，并将其开发成纳米传感器，当PDAC对应的蛋白酶存在时，会切割此探针，释放荧光信号。让我们一起来看一下这项最新研究。

　　实验方法：

　　1、探针的设计

　　研究人员使用了电荷变化蛋白酶(Charge-changing protease, CCP)检测法，此方法可以检测肽被裂解时底物分子的电荷从负电荷到正电荷的变化，并且在丙烯酰胺凝胶上可以分析由此产生的荧光产物。

　　为了筛选能够将PDAC与健康患者区分开来的蛋白酶底物，研究人员首先生成了12个肽探针，这些探针共包含38个独特的裂解位点和18个与CCP检测法兼容的共享裂解位点。比较了确诊PDAC的患者与健康对照者的血液样本，得到了8个具有阳性信号的探针(右)，之后又对裂解点位数及信号强度进行了优化，将探针范围缩小到6个(左)。

2、多重探针的性能验证

　　经过多组对比实验，上述六重探针不仅能够区分PDAC患者与健康对照，还能够将其他肿瘤、胰腺炎与PDAC患者区分开。此外，与肿瘤标志物CA 19-9相比，上述六重探针检测还能够在PDAC I期产生显著性的信号差异，而CA 19-9只能够在II期及以上的患者中显著性检测到，故而又验证了六重探针在早期检查中的应用潜力。

　　3、关键蛋白酶的探究

　　研究人员通过LC-MS对PDAC患者血清及健康对照组血清的裂解产物进行了分析，测量了每个探针的可能裂解位点的相关峰，分析得到了每个探针的裂解位点。为了锁定关键蛋白酶，使用ProCleave数据库进行了分析，锁定了代表性较强的三个蛋白酶家族：MMPs、cathepsins、caspases，然后结合LC-MS确定的裂解位点，发现MMPs家族可能裂解的探针数量最多(但MMPs家族没有可以裂解探针2的成员)。对MMP进行抑制后，发现除探针2外，其余5个探针的裂解率均下降，这说明MMP家族在探针的裂解中发挥了重要的作用(A图、B图)。为了进一步锁定关键蛋白酶，测定了健康对照组与PDAC患者血清中的MMP2、MMP9、MMP13的活性，发现只有MMP2存在显著差异(C图)。之后又对受MMP抑制剂影响最大的三个探针(1.4.6)和影响最小的三个探针(2.3.5)进行CCP信号-MMP2活性的相关性分析，发现1.4.6具有更强的正相关性(D图)。最后对血清中的总蛋白表达量进行了分析，发现MMP家族的表达量不存在显著差异(E图)，但将酶活性与MMP蛋白总浓度进行归一化之后，发现MMP2和MMP13在患者与健康人中存在显著差异(F图)。上述一系列结果证实了：MMP2是PDAC早期检测中的关键蛋白酶之一。后续对不同探针的排列组合进行分析后发现，只使用探针1也能够达到较好的检测效果。

　　4、PAC-MANN方法的建立

　　基于MMP2这一关键性生物标志物及上述开发的探针，研究人员建立了一种能够支持裂解产物的荧光读数的磁性纳米传感器，用于检测蛋白酶的活性：将探针链接在纳米氧化铁的表面，等探针被裂解之后，利用磁性将纳米粒子与裂解产物分离，从而使得荧光检测信号只来自于裂解产物(A图)。为了提高裂解位点的特异性，使用了哺乳动物蛋白酶无法裂解的D-氨基酸添加在蛋白侧翼，并检测了不同添加位置的蛋白酶折叠变化(B图)。之后使用此传感器进行检测，验证了其检测效果及特异性(C、D图)，并且具有较好的重复性(E图)。

5、临床样本的检测

　　使用PAC-MANN方法对PDAC患者、胰腺炎患者、胰腺肿瘤患者、健康人群的样本进行检测。PAC-MANN区分PDAC与非PDAC(胰腺炎、胰腺肿瘤、健康人群)的准确率为90%，对I期患者的灵敏度为62%，II期56%，III期92%，IV期85%，并且能够100%区分肿瘤患者与胰腺炎患者，上述数据均远优于CA 19-9检测。