RPA辅助CRISPR/Cas12a检测法：荧光与侧向流动条结合快速检测产肠毒素蜡样芽孢杆菌

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus，简称B. cereus）是一种常见的食源性病原菌，能够产生肠毒素，引发多种疾病。其中，腹泻症状主要由非溶血性肠毒素（NHE）和溶血素BL（HBL）引起。检测和控制B. cereus对于确保食品安全和保护人类健康至关重要。然而，传统的检测方法如实时荧光定量PCR（qPCR）和多重PCR（mPCR）等，存在操作复杂、需要专业设备和技术人员等局限性。

近期，一项发表于《Journal of Agricultural and Food Chemistry》的研究，介绍了一种基于RPA（Recombinase Polymerase Amplification）辅助的CRISPR/Cas12a双信号可视化检测平台，能在不到60分钟内快速、准确地检测出具有肠毒素产生潜力的蜡样芽孢杆菌，整个过程无需复杂操作或昂贵设备，堪称食品安全检测领域的一次革命。

核心技术解析

RPA（Recombinase Polymerase Amplification）

RPA技术是这项检测平台的基石之一。它是一种等温扩增技术，能够在恒定的37℃温度下，迅速扩增目标核酸片段。与传统的PCR技术相比，RPA无需复杂的热循环设备，操作更为简便快捷。在检测过程中，RPA首先对蜡样芽孢杆菌的六个肠毒素基因（nheA、nheB、nheC、hblA、hblC、hblD）进行单独扩增，为后续的CRISPR/Cas12a检测提供了充足的核酸模板。这种快速扩增能力，极大地缩短了检测时间，提高了检测效率。

CRISPR/Cas12a

CRISPR/Cas12a系统则是这项技术的另一大亮点。Cas12a蛋白在识别并结合到目标核酸序列后，会被激活产生反式切割活性，能够非特异性地切割附近的单链DNA（ssDNA），从而实现检测信号的快速放大。在检测平台中，CRISPR/Cas12a携带相应的crRNA，特异性识别并结合到蜡样芽孢杆菌肠毒素基因的核酸序列上，激活其反式切割活性，进而切割ssDNA报告探针，导致荧光信号或侧流层析试纸条上的信号发生变化，从而实现对目标肠毒素基因的检测。CRISPR/Cas12a系统的高特异性和灵敏度，使得检测结果更加准确可靠，即使在低浓度的目标核酸存在时也能够被精准检测到。

图1 RPA-CRISPR / Cas12a检测蜡样芽孢杆菌产生三联肠毒素平台示意图

实验结果

实验结果表明，该平台在荧光检测中对每个基因的检测限为10^-3 ng / μL，在LFA中为10^-4 ng / μL。此外，该平台还能检测到纯培养中的10¹-10² CFU / mL的B. cereus，显示出较高的灵敏度。通过智能手机小程序辅助评估LFA结果，进一步提高了检测的便捷性和准确性。在食品样本（牛奶和大米）中，该平台成功检测到了B. cereus，证明了其在实际应用中的有效性。

表1 蜡样芽孢杆菌检测方法的比较

创新点

双信号可视化检测：结合荧光和LFA双信号输出，结果直观易读，提高了检测的准确性和可靠性。

高灵敏度与特异性：通过RPA和CRISPR / Cas12a系统的双重特异性，实现了对六个肠毒素基因的高灵敏度和高特异性检测，检测限分别达到10^-3 ng / μL（荧光）和10^-4 ng / μL（LFA）。

快速与简便：整个检测过程不到60分钟，无需复杂操作或昂贵设备，适合现场快速检测。

智能手机辅助：通过智能手机小程序辅助评估LFA结果，进一步提高了结果判定的准确性和便捷性。

应用前景

食品安全检测：该平台能够快速、准确地检测食品中的B. cereus，适用于食品生产、加工和销售环节的现场快速检测，确保食品安全。

公共卫生监测：在公共卫生监测中，该平台可以快速检测环境样本中的B. cereus，及时发现潜在的污染源，预防食源性疾病的发生。

临床诊断：在临床诊断中，该平台可以快速检测患者样本中的B. cereus，辅助医生进行快速诊断和治疗。

科研应用：该平台为研究B. cereus的流行病学、基因组学和致病机制提供了有力的工具，有助于深入理解该病原菌的特性。

研究意义

该研究开发的RPA-CRISPR / Cas12a双信号可视化检测平台为快速、简便、准确地检测产肠毒素的B. cereus提供了一种新方法。该平台不仅提高了检测的灵敏度和特异性，还通过可视化和便捷的操作流程，为食品安全检测和公共卫生监测提供了一种有力的工具。未来，该平台有望在更多的食品样本和实际检测场景中得到应用和推广。

参考文献：

Li P R, Wang Z X, Xu Z K, et al. An RPA-Assisted CRISPR/Cas12a Assay Combining Fluorescence and Lateral Flow Strips for the Rapid Detection of Enterotoxigenic Bacillus cereus[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2024.