突破性研究：大规模单病毒基因组测序加速环境病毒的探索

　　一、病毒研究困境与突破契机

　　在生态系统的微观世界里，病毒虽微小却有着不可忽视的影响力，尤其是环境病毒中的噬菌体，在维持生态平衡方面扮演着关键角色。它们通过感染宿主细胞，深度参与营养和能量循环，推动着生态系统的持续运转。然而，长期以来，受病毒自身复杂特性的制约，我们对其基因组的认知极为有限，如同面对一座充满神秘的基因宝藏，难以窥探全貌。

　　传统的病毒宏基因组学在研究环境病毒时困难重重。病毒基因组高度镶嵌、突变和重组频繁，这使得在宏基因组组装过程中，大量病毒基因组信息缺失，就像拼图缺失了关键碎片，难以完整呈现病毒的真实面貌，进而导致我们对环境病毒的多样性及其功能的认识始终如雾里看花，模糊不清。

　　近日，《ISME Journal》杂志上发表了一篇题为《Large-scale single-virus genomics uncovers hidden diversity of river water viruses and diversified gene profiles》的研究论文，该研究由日本AIST-早稻田大学的Yohei Nishikawa团队主导完成。这项开创性的研究通过开发一种新的单病毒基因组测序平台，利用微流控技术生成的凝胶珠，大规模获取了河流水体中病毒的基因组，揭示了病毒的隐藏多样性和基因特征的分化，为理解病毒在生态系统中的作用提供了新的视角。

　　图1 凝胶珠能够在单颗粒水平上实现病毒的高通量WGA。(A)单病毒基因组学工作流程。用琼脂糖将病毒包裹在30 μm的微流控液滴中。琼脂糖凝固后，每个捕获在凝胶球中的病毒进行衣壳裂解和WGA。带有扩增DNA的凝胶珠用FACS分离，然后进行文库制备和高通量测序。(B) WGA后凝胶珠的显微图像。扩增后的病毒DNA用SYBR Green I染色，标尺为100 μm。(C)映射到Lambda和Charomid参考序列的序列读数比较。样本用需要映射的序列读数最多的参考文献标记。96个凝胶珠中只有4个含有1%的其他病毒序列，这表明DNA污染的风险很低。(D)每个凝胶球的基因组覆盖范围。

　　二、凝胶珠测序平台的工作原理与可靠性验证

　　在该平台的运作流程中，病毒被巧妙地包裹在直径30 μm的微流控凝胶珠内，随后进行衣壳裂解和全基因组扩增(WGA)。针对两种不同DNA类型的病毒(Lambda和Charomid 9-42)，研究人员在混合病毒的凝胶珠WGA实验中发现，3小时后DNA成功扩增，平均荧光阳性率达3.2%，病毒浓度经计算为9.4×10⁷ pfu/μg。经高通量测序，多数样本序列能准确匹配参考序列，且不同病毒序列污染风险较低，有力证明了该平台的可靠性与准确性。

　　图2 对从河流中收集的vSAGs和vMAGs进行序列质量评估。(A)对病毒悬液进行负染透射电镜成像，放大倍数为100000倍。从河流水中回收了各种形状的病毒样颗粒。大多数颗粒是分散的，而有些似乎物理上相互附着。比例尺为500纳米。使用两种不同的方法((I)抽吸过滤和(II)用FeCl₃沉淀)收集病毒，并对每种病毒悬液进行单病毒基因组学分析。从通过方法(I)收集的病毒悬液中提取宏基因组DNA。经过高通量测序以及vSAGs和vMAGs的构建，(B)评估了序列长度，(C)收集的数量以及通过CheckV估计的质量，(D)与IMG/VR v3数据库中的参考序列的序列相似性。如果平均核苷酸一致性(ANI)>95%且比对分数(AF)>85%，则判定病毒序列为已知序列(虚线框)。

　　三、河流水病毒研究的新发现与成果

　　将此技术应用于河流水病毒研究时，研究人员分别采用吸滤和氯化铁絮凝两种方法制备病毒样本，随后对1536个DNA扩增凝胶珠进行高通量测序，实验结果显示，基于凝胶珠的单病毒基因组测序平台显著提高了病毒基因组的获取效率：

　　病毒基因组的获取：通过两种方法(抽滤和化学絮凝)，共获得1431个vSAGs，显示出相较于传统单病毒基因组学方法的显著提升。

　　图3 1431个vSAG和100个vMAG的蛋白质共享网络。(A)利用vConTACT2以RefSeq参考数据库对1431个vSAG和100个vMAG进行蛋白质共享网络分析。仅展示与其他序列至少共享一个蛋白质簇的序列。(B) vSAG和vMAG在宏基因组原始读段中的相对丰度。纵轴表示映射到代表序列的宏基因组序列读段数量，以每碱基读段数的对数表示。(C)每个VC代表序列的宏基因组序列读段募集模式(也称为多样性曲线)。曲线表示在每个核苷酸一致性值下募集的序列读段百分比。

　　基因组质量评估：对vSAGs进行质量评估，结果显示67.0%的vSAGs为中高质量基因组，且99.5%的vSAGs在物种水平上被确定为新颖。

　　基因转移分析：通过比较基因组学分析，发现多种甲基转移酶亚型的多样性，表明这些基因可能帮助病毒逃避宿主细菌的内部防御机制。

　　图4 从多个病毒群中常见AMG的鉴定。(A)vSAG中AMG的分布情况。每行代表一个单独的vSAG，每列代表一个单独的AMG。实线分隔每个病毒群，病毒群内的亚簇由虚线分隔。AMG类别由DRAM-v确定。图的左侧显示vSAG的系统发育树，右侧的柱状图显示每个vSAG的完整性。顶部的直方图显示每个AMG出现在多个病毒群中的数量，表明有33种AMG出现在多个病毒群中，37种AMG出现在单个病毒群中。(B)检测到BTLCP的vSAG的ViPTree蛋白质组树。(C)TerL和(D)BTLCP的最大似然系统发育树。分支的SH类似aLRT支持率高于80%和超快引导95%的用黑点表示。如果这些分支仅由SH类似aLRT支持率高于80%支持，则显示为灰色。外圈的每种颜色代表不同的病毒群值。每个比例尺表示树的比例：1.

　　四、优点与创新

　　该论文提出了一种新型的基于微流体生成的胶珠的单病毒基因组测序平台，显著提高了环境病毒基因组的获取效率和多样性。

　　通过该平台，研究者成功获得了1431个不同的病毒单扩增基因组，绝大多数为新物种，填补了环境病毒基因组数据库的空白。

　　研究揭示了同一病毒物种内甲基转移酶亚型的多样性，暗示病毒可能通过基因重组逃避宿主细菌的防御机制，提供了对病毒生态学的新见解。

　　五、研究意义与未来展望

　　这项研究通过开发一种基于微流体生成的胶珠的单病毒基因组测序平台，显著提高了环境病毒基因组的获取效率和多样性。研究发现，从东京城市河流水样中获得了1431个多样化的病毒单扩增基因组，其中99.5%在物种水平上被确定为新颖。这一成果不仅揭示了环境病毒的丰富性和复杂性，还为理解病毒在生态系统中的作用提供了重要数据，推动了病毒基因组学的进展。

　　未来，研究者可以利用这一平台进行更大规模的病毒基因组测序，以探索病毒与宿主细菌之间的相互作用和基因转移机制。此外，结合时间序列采样和长读长测序技术，将有助于深入分析病毒群落的动态变化及其在生态系统中的功能，进一步揭示病毒在环境中的重要生态角色。

　　参考文献：

　　Nishikawa Y, Wagatsuma R, Tsukada Y, et al. Large-scale single-virus genomics uncovers hidden diversity of river water viruses and diversified gene profiles[J]. bioRxiv, 2024: 2024.04. 18.589877.