新型多重等位基因特异性PCR与DNA色谱技术：快速鉴定鼠伤寒沙门氏菌及其单相变体的基因型

在微生物研究领域，沙门氏菌一直是备受关注的焦点。其中，肠炎沙门氏菌鼠伤寒亚种（Salmonella Typhimurium）及其单相变体是引发全球人类和动物肠胃炎的重要病原体。随着其在传播过程中不断进化，基因多样性日益显著，如具有多重耐药性的DT104克隆以及在全球迅速蔓延的欧洲克隆等，给公共卫生和动物健康带来了严峻挑战。

传统的分子流行病学研究方法，如脉冲场凝胶电泳（PFGE）、多位点可变数目串联重复序列分析（MLVA）和多位点序列分型（MLST）等，虽各有优势，但也存在明显局限。PFGE耗时费力，DNA宏观限制性片段分析难以精确反映系统发育信息；MLST对亲缘关系相近菌株的鉴别能力不足；MLVA虽分辨率高，但同样无法全面呈现基因组信息。在此背景下，一种新型的基因分型方法应运而生，为沙门氏菌研究带来了新的突破。

新型基因分型方法的构建与原理

日本的Nobuo Arai团队研发了一种结合多重等位基因特异性PCR（multiplex allele-specific PCR）和DNA色谱技术的基因分型方法。研究团队收集了115株在日本获得的沙门氏菌菌株，其中103株Salmonella Typhimurium和Salmonella 4,[5],12:i:-已通过全基因组测序被分为九个进化枝。首先，将菌株在LB琼脂培养基上培养，经一系列处理后提取DNA作为模板。多重AS-PCR反应体系包含模板DNA、dNTPs、PCR缓冲液、KOD FX DNA聚合酶及特定引物，在特定的热循环条件下进行扩增。反应完成后，利用单标签杂交（STH）色谱印刷阵列条（PAS）方法进行DNA色谱分析。

该方法的关键在于设计了针对不同基因位点的特异性引物，这些引物能够识别沙门氏菌的单核苷酸多态性（SNP）以及鼠伤寒特异性区域（TSR）。当测试菌株为具有基因型特异性SNP的Salmonella Typhimurium或Salmonella时，AS-PCR可成功扩增出TSR和包含基因型特异性SNP的区域，后续DNA色谱步骤中会出现对应信号，从而确定菌株的SNP基因型。例如，在实验中，对于不同的SNP基因型菌株，如基因型1-9，其对应的引物扩增产物在色谱条上呈现出特定的信号组合，与琼脂糖凝胶电泳结果相吻合。

图1 鼠伤寒沙门菌和沙门菌的SNP基因分型。泳道编号按SNP基因型顺序排列。(A)蓝线表示每个SNP基因型或鼠伤寒特异性区域（TSR）。红线是位置标记。(B)多重等位基因特异性PCR结果。泳道M表示100 bp的DNA marker。每个约500 bp的条带表示SNP基因型；94-bp、196-bp和303-bp分别为TSR1、TSR2和TSR3。

新型方法的准确性验证与优势展现

为验证该方法的准确性，研究团队使用了先前已确定全基因组序列的103株菌株进行测试。结果显示，其中95株属于特定SNP基因型的菌株均被成功鉴定，对于不属于SNP基因型的菌株（不可分型菌株）仅出现TSR相关信号，且所有菌株的SNP基因型与基于序列的进化枝分类完全一致，充分证明了该方法的可靠性。

表1 鼠伤寒沙门菌及其单相变异菌株的SNP基因分型结果

与传统方法相比，此新型基因分型方法优势显著。它无需进行琼脂糖凝胶电泳，每个样本在单次反应中即可确定SNP基因型，大大节省了时间和人力成本。以往的SNP基因分型虽在一定程度上减少了时间和劳动消耗，但需进行九次PCR操作，过程较为复杂。而新方法将多重AS-PCR和DNA色谱技术相结合，简化了操作流程，提高了检测效率。

未来展望：拓展应用范围

尽管目前该方法主要针对纯化的菌株进行了优化，但研究团队也意识到未来探索其在粪便、食品等粗样本中应用的重要性。这将进一步拓展该方法在实际检测中的应用范围，使其在疫情监测、食品卫生检测等领域发挥更大的作用。例如，在食品供应链中，能够快速准确地检测出沙门氏菌的基因型，有助于及时追溯污染源，采取有效的防控措施，保障公众健康。

这种新型基因分型方法为沙门氏菌的分子流行病学研究提供了一种高效、准确的工具，在应对沙门氏菌引发的公共卫生问题方面具有重要的应用前景，有望推动相关领域的研究取得进一步发展。

参考文献：

Arai N, Tamamura-Andoh Y, Iwata T, et al. Multiplex allele-specific PCR and DNA chromatography to identify genotypes of Salmonella enterica serovar typhimurium and its monophasic variants[J]. Journal of Microbiological Methods, 2024: 107082.