废水耐药监测新突破：CRPA检测的高效标准化流程

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一种广泛存在于潮湿环境中的非发酵性革兰氏阴性杆菌，能够形成生物膜，难以从水源中根除。碳青霉烯类耐药性（Carbapenem resistance）是铜绿假单胞菌中最令人担忧的耐药形式之一，使其成为世界卫生组织（WHO）认定的高优先级病原体，因为它能够引起难以治疗的严重感染。目前，检测CRPA的方法主要针对临床样本，缺乏专门针对水样的检测方法。为此，Selvi N. Shahab等人通过优化培养基（固体和液体）及抗生素组合、培养步骤等（图1-图2），开发出了一种CRPA标准化检测流程。此流程可概括如下：

（1）样本预处理。针对大体积水样（≥100 mL），可用0.45微米的硝酸纤维素滤膜对水样进行过滤，以浓缩水样中的细菌，以提高检测的灵敏度。

（2）预富集培养。使用天冬氨酸脯氨酸肉汤（Asparagine Proline Broth, ASP）作为富集肉汤，并加入万古霉素（2 mg/L）以抑制革兰氏阳性菌的生长。培养条件：37 °C下培养18-24小时。

（3）平板培养。将富集后的样本接种到改良铜绿假单胞菌琼脂C（Modified Pseudomonas Agar C, M-PA-C）平板上，于37°C下培养18-24小时。此选择性平板中内含亚胺培南（8 mg/L）作为选择性抗生素。

（4）鉴定与确认。观察平板上的菌落形态，典型的CRPA菌落呈粉红色或棕粉色。并利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）对疑似CRPA菌落进行物种鉴定。对鉴定为铜绿假单胞菌的菌落进行碳青霉烯类抗生素的耐药性测试，确认其是否为CRPA。

基于此流程，研究可对人工污染的废水样本中CRPA：1-10 CFU进行定量检测（表1-表2），具有极好的灵敏度和特异性。研究中，作者观察到，亚胺培南在不同阶段的加入会对预测准确性造成较大的影响：加在增菌液中会降低检测限，加在琼脂选择培养基中会提高检测限。尽管如此，本流程的阳性预测价值也有限（73%）。另外，本研究尚未应用于真实样本中CRPA的定量检测，且测试的样本来源及数量均存在局限性。这些因素都是未来将该流程发展为真正标准化的CRPA检测流程所需改进的地方。

图1  CRPA检测流程的系统优化示意图

图2  本研究的方案优化流程。步骤1：选择性平板的优化及选择。利用7种基因型且来源不同的CRPA菌株，评价常用的4种选择性琼脂平板（M-PA-C、CHROMagar、CN agar、mZ-agar）在补充不同碳青霉烯类抗生素（亚胺培南、美罗培南、头孢他啶）后检测CRPA的表现。在这里，通过观察菌落形态和生长情况，确定了M-PA-C和CHROMagar平板在检测CRPA时表现最佳。步骤2：预增菌液的优化及选择。利用上述7种CRPA菌株，评估了2种富集肉汤（TSB和ASP）在添加不同抗生素组合后的表现。通过比较7种CRPA菌株在富集培养后的生长情况，确定了在添加万古霉素（2 mg/L）的情况下，TSB和ASP均能有效支持CRPA的生长，同时抑制大多数革兰氏阳性菌的生长。此外，研究还发现，在富集肉汤中添加亚胺培南（8 mg/L）可以进一步提高对CRPA的选择性，但可能会对某些CRPA菌株的生长产生一定的抑制作用。步骤3：膜过滤的必要性及影响。膜过滤可以浓缩水样中的细菌，适用于处理大体积水样，从而提高检测的灵敏度。然而，直接将过滤后的样本接种到选择性平板上会导致大量背景菌落的生长，降低阳性预测值（PPV）。因此，膜过滤虽然有助于浓缩细菌，但需要结合后续的富集步骤来提高检测的特异性。步骤4：富集流程的确定。通过评估直接接种选择性平板及富集后再接种选择性平板的CRPA及背景干扰菌的生长情况，优化了实验流程。结果表明，富集步骤可以显著减少背景菌落的干扰，提高检测的特异性和阳性预测值（PPV）。因此，推荐在检测流程中加入富集步骤，以提高检测的准确性和可靠性。步骤5：亚胺培南的加入位置。比较了在富集肉汤中添加亚胺培南与在选择性平板上添加亚胺培南的效果。结果表明，在选择性平板上添加亚胺培南可以提高检测的灵敏度，但可能会降低阳性预测值（PPV）。相反，在富集肉汤中添加亚胺培南可以提高PPV，但会增加检测限。因此，最终推荐在选择性平板上添加亚胺培南，以实现高灵敏度和高特异性的平衡。步骤6：得出最终的优选方案。

表1  不同富集方法和选择性平板组合在检测PA及CRPA时的性能比较

表2  亚胺培南添加在增菌液或选择性平板中对7例人工污染废水样品中CRPA的检测限比较

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2024.178086