基于RPA-CRISPR/Cas12,13的诺如病毒和轮状病毒现场快速双重检测方法研究

一、研究背景与意义

1. 病毒危害与检测需求

诺如病毒（NoV）和轮状病毒（RoV）是导致感染性胃肠炎的最主要食源性病毒，在果蔬中污染率高，可通过污染的食物、水或接触传播，严重威胁公共健康。

据WHO数据，诺如病毒每年导致6.84亿感染病例和2.12万死亡，经济损失达42亿美元；

轮状病毒是5岁以下儿童重症腹泻的首要原因，每年导致12.2万-21.5万儿童死亡。

此外，两者在果蔬中常同时污染，存在共感染风险，因此亟需快速、特异、灵敏的同步检测技术。

2. 现有检测方法的局限性

传统分子方法（如RT-qPCR）：灵敏度高但依赖精密仪器和热循环程序，不适合现场检测；

等温扩增技术（如LAMP、RPA）：更适合现场检测，但LAMP需设计4-6条引物，RPA存在非特异性扩增问题；

单一CRISPR/Cas系统：虽特异性强，但灵敏度不足，需与扩增技术结合。

二、研究目的

建立一种现场实时双重检测方法，实现对GI-NoV和A-RoV的同步检测，满足以下需求：

快速：缩短检测时间，适应现场即时检测（POCT）；

特异：仅识别目标病毒，无交叉反应；

灵敏：满足低浓度病毒（如食物中残留）的检测需求；

便捷：操作简单，设备依赖低，结果易读取。

三、核心技术方法

该方法整合了重组酶聚合酶扩增（RPA） 与CRISPR/Cas12a/Cas13a系统，利用两种Cas蛋白的切割偏好实现单管双重检测，具体流程如下：

1. 样本处理

从食物样本（如草莓、生菜）中提取病毒RNA，反转录为cDNA。

2. 多重RPA扩增

设计特异性引物，同时扩增GI-NoV和A-RoV的靶基因：

GI-NoV：用常规引物扩增DNA产物，供Cas12a识别；

A-RoV：用带T7启动子的引物扩增，后续通过T7转录生成RNA，供Cas13a识别。

3. CRISPR/Cas双重检测

在单管中加入两种Cas蛋白及对应荧光探针：

Cas12a：识别GI-NoV的DNA产物，激活后切割带ROX荧光基团的ssDNA探针，释放荧光；

Cas13a：识别A-RoV的RNA产物（T7转录生成），激活后切割带FAM荧光基团的ssRNA探针，释放荧光。

4. 结果读取

定量：通过荧光检测仪监测ROX和FAM信号；

定性：蓝光下观察颜色变化（双阳性为黄色，单阳性分别为红色/绿色，阴性无荧光）。

图1 单管 RPA-CRISPR/Cas12,13 双重检测方法示意图。（A）整个检测过程的主要步骤。（B）利用 Cas12a 和 Cas13a 同步检测 GI-NoV 和 A-RoV 的原理示意图。

 四、关键结果

1. 特异性

仅对GI-NoV和A-RoV产生阳性信号，与其他4种食源性病毒（如人星状病毒、肠道腺病毒）无交叉反应，验证了方法的高特异性。

图2 RPA-CRISPR/Cas12,13 双重检测方法的特异性。（A）反应结束时，GI-NoV、A-RoV 及其他四种常见食源性病毒的荧光值。（B）不同测试样本在 ROX 和 FAM 通道中的荧光变化。（C）蓝光下的可视化检测结果。

2. 灵敏度

纯质粒样本中，两种病毒的检测限均为10² copies/μL；

图3 RPA-CRISPR/Cas12,13 双重检测方法的灵敏度。（A）反应结束时，不同浓度混合标准阳性质粒的荧光值。（B）不同浓度混合标准阳性质粒在 ROX 和 FAM 通道中的荧光变化。（C）蓝光下的可视化检测结果。

人工污染的草莓和生菜中，检测限低至1.6×10⁵ copies/g，满足实际食物样本检测需求。

图4 采用 RPA-CRISPR/Cas12,13 双重检测方法对人工污染样本的检测结果。（A）反应结束时，人工污染草莓样本的荧光值及蓝光下的可视化检测结果。（B）反应结束时，人工污染生菜样本的荧光值及蓝光下的可视化检测结果。

3. 检测效率

全程在37℃下完成，耗时仅60分钟（RPA扩增30分钟+CRISPR检测30分钟），远快于传统RT-qPCR（需数小时）。

4. 实用性

无需复杂仪器，仅需恒温设备和蓝光灯即可完成检测，结果可视化效果好，适合现场操作。

五、方法优势

1. 技术整合创新：结合RPA的快速扩增与CRISPR/Cas的高特异性，解决了RPA非特异性扩增问题，同时提升了检测灵敏度。

2. 双重检测能力：利用Cas12a（切割DNA）和Cas13a（切割RNA）的正交性，实现单管同步检测，减少操作步骤和污染风险。

3. 现场适用性：低设备依赖、快速、可视化，突破了传统方法在现场检测中的限制。

4. 食品基质兼容性：在草莓和生菜中验证了有效性，克服了食物成分对检测的干扰。

六、局限性与展望

1. 局限性

未评估不同洗脱缓冲液或富集方法对病毒回收率的影响，可能存在提升空间；

灵敏度略低于TaqMan RT-PCR（但已满足实际需求）；

仅针对GI-NoV和A-RoV，未涵盖其他基因型（如GII-NoV）。

2. 未来方向

优化样本前处理步骤，进一步提升食物中病毒的回收率；

扩展检测范围，纳入更多病毒基因型；

开发冻干试剂，提高方法的稳定性和便携性。

七、总结

该研究开发的RPA-CRISPR/Cas12a/13a双重检测方法，为食源性病毒的现场快速检测提供了可靠技术方案，兼具高特异性、灵敏度和实用性，对预防食源性疾病暴发、保障食品安全具有重要参考价值。

参考文献：

Le X, Jiang J, Hong Y, et al. Development of an on-site real-time dual detection method for norovirus and rotavirus using RPA-CRISPR/Cas12, 13[J]. Food Control, 2025, 168: 110943.