基于SG4MB/SRCA比色生物传感器的食品中沙门氏菌检测研究

一、研究背景与意义

沙门氏菌是全球最常见的食源性病原体之一，可通过污染禽肉类、蛋类、乳制品等食品引发人类肠胃炎甚至败血症，每年导致全球约6亿人患病、42万人死亡（WHO数据）。在我国，80%的食源性细菌暴发事件由沙门氏菌引起，严重威胁食品安全与公共健康。

传统检测方法（如ISO 6579-1生化培养法）需1周时间，且依赖操作人员主观判断，难以满足快速检测需求。核酸扩增技术（如PCR）虽灵敏但依赖昂贵设备，而等温扩增技术（如SRCA）操作简便但易受污染导致假阳性。因此，开发高灵敏、高特异、适合现场快速检测的沙门氏菌检测方法具有重要意义。

二、研究目的

首次将跳跃式滚环扩增（SRCA）技术与分裂G-四链体序列（SG4MB）结合，构建SG4MB/SRCA比色生物传感器，实现食品中沙门氏菌的可视化定性检测与吸光度定量分析，弥补现有方法的缺陷。

三、技术原理与方法

1. 核心技术原理

SRCA技术：基于沙门氏菌保守毒力基因invA设计特异性引物，在恒温条件下通过Bst DNA聚合酶实现靶序列的指数级扩增，产物为串联重复的双链DNA。

SG4MB探针：含分裂G-四链体序列，其环部与SRCA扩增产物互补。无靶标时，SG4MB形成G-四链体结构，与血红素（hemin）结合后模拟过氧化物酶活性，催化ABTS-H₂O₂体系显色（深绿色）；有靶标时，SG4MB与SRCA产物结合，G-四链体结构被破坏，显色减弱（浅绿色），通过颜色变化或420nm吸光度实现检测。

图1基于 SG4MB/SRCA 的沙门氏菌比色生物传感器检测示意图。

2. 实验设计与优化

靶标选择：以沙门氏菌保守invA基因为检测靶标，设计特异性引物（FWP：20 bp，RVP：22 bp），确保扩增特异性。

反应条件优化：通过单因素实验确定最佳参数：SG4MB环长14 bp、浓度0.5 μmol/L，反应温度58℃、时间50 min，hemin浓度3 μmol/L，ABTS孵育8 min。

验证实验：测试23株常见致病菌（8株沙门氏菌+15株非沙门氏菌）的特异性；通过梯度浓度菌液测定灵敏度；在人工污染牛奶样本中验证回收率；对60份市场食品样本与国标方法（GB 4789.4-2024）对比。

四、研究结果

1. 特异性与灵敏度

特异性：仅8株沙门氏菌显浅绿色（低吸光度），15株非沙门氏菌（如大肠杆菌、李斯特菌）均显深绿色（高吸光度），与空白组无显著差异（P > 0.05），证明特异性良好。

图2 特异性分析。(A) 琼脂糖凝胶电泳结果。泳道 M：100 bp 分子量标准；泳道 N：空白组；泳道 1-8：沙门氏菌；泳道 9-23：非沙门氏菌菌株（详见表 1）。(B) 沙门氏菌菌株与非沙门氏菌菌株在 420 nm 处的吸光度（详见表 1）。插图为相应体系的照片。

图3 特异性分析。(A) 琼脂糖凝胶电泳结果。泳道 M：100 bp 分子量标准；泳道 N：空白组；泳道 1-8：沙门氏菌；泳道 9-23：非沙门氏菌菌株（详见表 1）。(B) 沙门氏菌菌株与非沙门氏菌菌株在 420 nm 处的吸光度（详见表 1）。插图为相应体系的照片。

灵敏度：在5.2×10¹ ~ 5.2×10⁶ CFU/mL范围内线性关系良好（R²=0.992），检测限（LOD）低至4.33 CFU/mL，远低于致病阈值（10³ CFU/mL），可视化检测限为5.2 CFU/mL。

图4 跳跃式滚环扩增（SRCA）与聚合酶链式反应（PCR）检测沙门氏菌的灵敏度分析（A）SRCA 方法检测沙门氏菌的凝胶电泳图；（B）PCR 方法检测沙门氏菌的凝胶电泳图；1-9：5.2×10⁷~5.2×10⁻¹ CFU/mL；N：空白组。

表1 不同沙门氏菌检测方法的比较

2. 实际样本应用

人工污染牛奶：在2.4×10¹ ~ 2.4×10⁶ CFU/mL范围内线性良好（R²=0.993），LOD为6.89 CFU/mL，回收率95.0%~105.4%，相对标准偏差（RSD）1.3%~3.2%，抗干扰能力强。

图5 牛奶样品中沙门氏菌的检测限分析。(A) 可视化检测限分析；(B) 不同稀释度下沙门氏菌的吸光度；(C) 人工接种沙门氏菌的牛奶样品中，LgC（CFU/mL）与溶液在 420 nm 处吸光度的线性关系。

市场食品样本：60份样本中，该方法与国标方法的相对灵敏度100%、特异性98.04%、符合率98.33%，证明实际应用价值。

表2 牛奶样品中人工接种沙门氏菌的加标回收率及相对标准偏差

五、创新点与优势

1. 技术创新：首次将SRCA与SG4MB结合，利用SG4MB特异性识别SRCA产物，避免非特异性扩增导致的假阳性，同时通过比色信号简化检测流程。

2. 性能优势：

灵敏度高：LOD（4.33 CFU/mL）优于PCR（10² CFU/mL）和传统SRCA（10¹ CFU/mL）；

操作简便：无需昂贵设备，可视化结果可现场判断；

适用范围广：覆盖低浓度污染（如环境监测）到高浓度样本（如富集后食品）。

六、结论与展望

本研究构建的SG4MB/SRCA比色生物传感器实现了食品中沙门氏菌的高灵敏、高特异检测，为食源性致病菌快速筛查提供了新工具。未来可通过修改探针识别序列扩展至其他病原体检测，在食品安全监管、临床诊断等领域具有广阔应用前景。

参考文献：

Wang X, Zhang Y, Di H, et al. Detection of Salmonella in food by SG4MB/SRCA based colorimetric biosensor[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2025: 107677.