DNA连续监测，粒子运动传感器革新生物制造质量控制

原创

来源：贺鹏霖

2025-08-22 10:12:49

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核心提示：荷兰埃因霍温理工大学团队开发出全球首个基于粒子运动生物传感（BPM）的连续监测传感器，可实时追踪生物制造过程中双链DNA片段（dsDNA）的浓度变化（范围：nM–μM）。该传感器通过抗dsDNA抗体竞争机制，结合微流控与显微追踪技术，实现无需试剂消耗、序列非依赖的连续监测，为细胞死亡预警与药物杂质控制提供全新工具。

研究背景

生物制造过程使用活细胞及其成分来生产生物制药、病毒载体和基于细胞的疗法等。这些生物过程很复杂，因此需要深入研究以确定变异性的来源并确保一致的产品质量。当使用连续传感器自动生成测量数据时，可以实现优化的过程控制，从而消除与场外实验室分析相关的延迟。为了监测生物制造过程中的小有机分子、蛋白质和核酸，市场上还没有连续传感器。为此类生物分子开发连续传感器具有挑战性，因为它们的浓度较低，通常为微摩尔浓度及以下。

可以监测生物反应器中细胞状态的连续传感器将为先进的过程控制提供机会。需要监测的一个重要现象是细胞死亡，因为这可能与细胞中的生理过程以及生物反应器中的有害条件有关。可以通过测量膜和细胞内成分释放到生物反应器中来检测细胞死亡，包括宿主细胞蛋白（HCP）和宿主细胞 DNA （HCD）。这些分子与生物反应器内部（上游加工）以及之后的提取和纯化步骤（下游加工）的测量相关，以提高过程控制和产品安全性。

HCD 可以量化为样品中细胞外 DNA 片段的总质量。在细胞死亡时，细胞的基因组 DNA 被细胞死亡过程本身以及生物反应器中的剪切力碎片化。HCD 定量的黄金标准是定量 PCR。然而，PCR 使用序列特异性引物，限制了其量化总基因组 DNA 的能力。本研究的传感器采用竞争形式设计，传感表面有抗dsDNA抗体，颗粒上有dsDNA片段。这些抗体识别dsDNA的糖磷酸骨架，使dsDNA能够与dsDNA进行序列独立结合。

研究原理

图1 用于生物过程中dsDNA片段连续监测的传感器

该传感器基于直径为 1 μm 的生物功能化颗粒，与生物功能化传感器表面相互作用。这些粒子在靠近表面的距离内表现出扩散布朗运动，距离约为 1 μm，由布朗运动和重力之间的平衡决定。使用配备高速相机的定制微型显微镜记录选定视场（FOV）中数百个粒子的运动。粒子跟踪软件用于建立粒子的位置，从中确定每个粒子的扩散率（D）随时间变化。测量扩散率的直方图显示了两个不同的群体，反映了粒子的束缚和未束缚状态。

制造概念验证传感器的起始材料是聚苯乙烯表面和链霉亲和素涂层颗粒。表面通过物理吸附涂有抗 dsDNA 抗体，并用牛血清白蛋白（BSA）阻断以减少非特异性相互作用。这些颗粒用 50 个碱基对的生物素化 dsDNA 进行功能化，并用生物素-mPEG（聚乙二醇）和 BSA 封闭，以抑制与表面的非特异性相互作用。在这种竞争性传感器格式中，当溶液中不存在 dsDNA 片段时，颗粒很有可能与表面的抗体结合，导致颗粒通常处于低扩散率的结合状态。当dsDNA片段存在于溶液中时，它们会与表面的抗体结合，从而降低颗粒与表面结合的概率，从而导致颗粒的未结合状态。随着时间的推移，对 FOV 中所有粒子的状态进行监控。传感器的主要读出参数是结合分数，它定义为结合状态的种群与状态总数之间的比率，在测量持续时间内确定 FOV 中所有跟踪粒子。

研究结果

1. 分子设计可行性（96孔板实验）

- 特异性验证（图2A）：

增加抗体密度（1→10 nM）与微粒DNA密度（0→200 nM）可使结合分数从20%升至80%，证实结合由特异性抗体-DNA驱动。

- 可逆性验证（图2C）：

向预结合体系中加入dsDNA（5–50 nM），5分钟内结合分数下降40–80%，证明竞争反应快速可逆。

图2：孔板实验验证传感器分子性能

2. 片段长度效应（微流控实验）

图3：片段长度对传感器响应的影响

在实验过程中，研究者发现，传感器长片段dsDNA灵敏度显著更高。抗dsDNA抗体通过双价结合（monogamous bivalency）稳定吸附DNA，需最小长度≈16 bp以实现双位点锚定（图3）。

3. 粒子运动行为解析（图4）

通过扩散率直方图识别微粒三种运动状态：

扩散率范围	运动状态	结合模式
D < 0.03 μm²/s	强受限运动	多抗体-DNA键
0.03 < D < 0.15 μm²/s	受限运动	单抗体-DNA键
D > 0.15 μm²/s	自由运动	无结合

dsDNA浓度升至100 nM时，切换态微粒比例下降（抗体饱和），非结合微粒比例上升（竞争增强）。

图4：微粒运动状态分类与浓度响应

4. 连续监测能力（图5）

在交替注入1 nM与100 nM dsDNA的实验中：

- 高浓度响应：100 nM注入1分钟内结合分数骤降，响应快速（<1 min）。

- 低浓度恢复：1 nM注入后结合分数缓慢上升（释放动力学较慢）。

传感器可逆响应浓度升降，首次实现无试剂消耗的dsDNA连续追踪。

图5：交替浓度下的连续监测演示

效果与展望

使用自由颗粒运动生物传感（f-BPM）和竞争性传感器设计，在传感表面具有抗 dsDNA 抗体，在颗粒上具有 dsDNA ，可以实现对纳摩尔到微摩尔浓度的 dsDNA 片段的连续监测。该传感器独立于 dsDNA 序列，因为抗体靶向 DNA 的糖磷酸骨架。此外，该传感器可以检测不同大小的 dsDNA 片段，并被证明是可逆的，显示出对增加和交替的 dsDNA 片段浓度曲线的响应。无需消耗试剂即可连续监测 dsDNA 的能力是该传感器的独特特性。但使用 f-BPM 传感器进行的连续测量仅限于低流速，以最大限度地减少流动引起的颗粒损失。在颗粒和表面之间具有系绳分子（t-BPM）的 dsDNA 传感器的制造将允许以更高的流速和更长时间的测量替代流体，以研究传感器动力学、测量精度、定量极限和测量精度等主题。