超灵敏荧光侧向层析免疫测定：AIENP@Ni/EC纳米复合材料实现果蔬中氯噻酮、多效唑与氟虫腈的同步快速检测

1.引言

农药在现代农业中不可或缺，但滥用或过量使用会导致果蔬中多种农药残留超标，威胁人体健康。现有检测方法如液相色谱-质谱（LC-MS）、气相色谱-质谱（GC/MS）等虽准确，但操作复杂、耗时且不适合现场检测。传统多重侧向层析免疫测定法（M-LFIA）多采用单色或单一荧光标记，易因检测线密集导致结果误判，且灵敏度有限。故本研究开发基于其的T-FLFIA以解决上述问题。

本研究开发了一种基于交通信号灵感的荧光侧向层析免疫测定法（T-FLFIA），利用自组装的AIENP@Ni/EC纳米复合材料作为三色荧光探针，实现CTN、PBZ、FIP的同步快速检测。该材料结合聚集诱导发光体（AIEgens）的强荧光特性与Ni/EC金属-多酚网络的良好生物相容性，解决了传统方法灵敏度低、识别困难的问题。

图1.一种受交通信号启发的荧光侧流免疫分析（T-FLFIA）方案，用于检测百菌清（CTN）、多效唑（PBZ）和氟虫腈（FIP）。(A)三色AIENP@Ni/EC的合成方案。(B)基于T-FLFIA对苹果和菜豆中CTN、PBZ和FIP的同步定量检测，与传统比色M-LFIA的对比。

2.结果与讨论

AIENP@Ni/EC纳米复合材料的合成与表征：通过一步法自组装制备AIENP@Ni/EC，AIEgens疏水聚集成核，EC与Ni²⁺配位形成金属-多酚网络包覆。表征显示其为球形，粒径155-188nm，有绿、黄、红三色荧光，稳定且分散均匀。

图1.G-AIENP@Ni/EC的合成与表征。(A)G-AIENP@Ni/EC合成的示意图。(B)在不同有机溶剂中合成的G-AIENP@Ni/EC的发射光谱。(C)相对荧光强度（αAIE=I/I₀，I₀=纯有机溶剂在最大发射波长处的荧光强度）的曲线图。(D)在不同有机溶剂中合成的G-AIENP@Ni/EC的动态光散射分析。(E)Ni²⁺浓度变化时合成的G-AIENP@Ni/EC的发射光谱。(F)不同Ni²⁺浓度合成的Ni/EC络合物的紫外-可见光谱。(G)Ni²⁺浓度变化时合成的G-AIENP@Ni/EC的动态光散射分析。

T-FLFIA的开发与优化：通过静电作用将三色AIENP@Ni/EC与对应抗体偶联制备免疫探针，在硝酸纤维素膜设三条检测线和一条质控线组装检测条，优化抗体用量、缓冲液pH等参数以确保检测效果。

图2.多色AIENPs@Ni/EC的表征。(A)G-AIENP@Ni/EC的荧光激发和发射光谱（插图：G-AIENP@Ni/EC在日光和紫外光下的图像）。(B)G-AIENP@Ni/EC的TEM表征和元素分布图。(C)G-AIENP@Ni/EC的DLS分析。(D)Y-AIENP@Ni/EC的荧光激发和发射光谱（插图：Y-AIENP@Ni/EC在日光和紫外光下的图像）。(E)Y-AIENP@Ni/EC的TEM表征和元素分布图。(F)Y-AIENP@Ni/EC的DLS分析。(G)R-AIENP@Ni/EC的荧光激发和发射光谱（插图：R-AIENP@Ni/EC在日光和紫外光下的图像）。(H)R-AIENP@Ni/EC的TEM表征和元素分布图。(I)R-AIENP@Ni/EC的DLS分析。

单一农药残留检测：在优化条件下，T-FLFIA用三种荧光免疫探针检测CTN、PBZ、FIP，线性范围分别为0.05-100、0.05-250、0.05-10ng/mL，LOD低至0.033-0.048ng/mL，且无交叉反应。

图3.T-FLFIA对单一农药残留检测的评估。标准曲线：(A)CTN，(B)PBZ，(C)FIP检测。(D)三种免疫探针的交叉反应性评估。在阴性条件下，条带1-3分别只含有绿色、黄色和红色免疫探针。条带4-11含有三种免疫探针的混合物。条带4：在阴性条件下，三种免疫探针均与其对应的固定在T线上的抗原结合。条带5-11：不同的阳性条件（-代表阴性：0ng/mL，+代表阳性：100ng/mL）（n=3）。

T-FLFIA性能评估：T-FLFIA对CTN、PBZ、FIP同步检测LOD为0.025-0.046ng/mL，较传统AuNPs-M-LFIA灵敏度提升3.37-5.52倍，定性准确率达92.5%，5s读数，抗体和探针用量更少。

图4.T-FLFIA与比色M-LFIA性能比较。(A)使用AuNPs作为免疫探针的T-FLFIA和传统比色M-LFIA的示意图。(B)使用AIENP@Ni/EC-mAbs对混合农药（CTN+PBZ+FIP）不同浓度响应的三个T线荧光强度。(C)使用AuNP-mAbs对混合农药不同浓度响应的三个T线颜色强度。CTN、PBZ和FIP的同时(D)荧光检测和(E)比色检测校准曲线。

T-FLFIA方法学评价：T-FLFIA特异性强，对12种类似物无交叉反应；苹果和豇豆中加标回收率90.2%-114.0%，变异系数<10%，与LC-MS结果一致，稳定性良好。

图5.使用当前T-FLFIA对三种农药残留的同步检测。(A)T-FLFIA的特异性评价(B)T-FLFIA对苹果和菜豆中CTN、PBZ和FIP的同步检测的精密度和准确度。

3.总结

本研究开发的T-FLFIA基于三色AIENP@Ni/EC纳米复合材料，实现了果蔬中CTN、PBZ、FIP的同步快速检测，具有高灵敏度（LOD低至0.025ng/mL）、高准确性（92.5%）、快速（5s读数）及良好稳定性等优势。该方法无需复杂设备，适合现场大规模筛查，为农产品中多种农药残留检测提供了实用、低成本的新工具。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.157565