RPA-CRISPR/Cas12a耦合微流控生物传感器实现副溶血性弧菌现场灵敏定量检测

1.引言

副溶血性弧菌是海产品相关胃肠炎和水产动物疾病的重要病原菌。食品风险分级、养殖病害预警及污染干预不仅需要判断样品中是否存在病原体，还需要快速获得病原菌负荷。qPCR和数字PCR具有良好的定量能力，但依赖精密温控、昂贵仪器和专业操作，限制了其在养殖场、海产品市场及资源受限场景中的现场应用。RPA-CRISPR/Cas12a等温检测能够降低设备依赖，但现有方法多集中于定性或半定量分析，其信号易受环境温度、反应批次和人工操作影响，难以在现场稳定构建标准曲线。

本研究提出“运行内校准”策略，将梯度浓度toxR标准质粒、冻干RPA-CRISPR/Cas12a试剂和样品检测单元集成于封闭式离心微流控芯片中，在同一次反应内同步完成标准曲线构建和未知样品分析。芯片通过离心力与毛细作用自动完成试剂复溶、混合、定量分配及反应，便携设备则集成离心、39℃等温加热、实时荧光采集和数据分析，从而形成适用于现场定量检测的完整技术体系。

2.结果与讨论

ORCMB总体检测流程与快速定量框架：海产品样品经匀浆后采用现场煮沸裂解提取DNA，提取液加入芯片样品仓，经离心完成冻干试剂复溶和反应液分配。芯片内的一锅法RPA持续扩增toxR靶序列，扩增产物激活crRNA-Cas12a复合物并切割FAM-BHQ1标记的单链DNA报告探针，产生实时荧光信号。系统以荧光曲线拐点时间（time to POI）作为定量参数，将样品POI值代入同批次生成的标准曲线反算靶DNA浓度。与传统生化培养超过2 d和qPCR超过5 h的流程相比，ORCMB从样品采集到定量结果约需1.5 h。

图 1 传统培养、qPCR与ORCMB检测流程比较：传统培养需连续稀释、平板培养和生化鉴定，获得定量结果通常超过2 d；qPCR完成DNA提取、扩增及标准曲线分析需5 h以上；ORCMB通过现场煮沸裂解、离心微流控分配和一锅法RPA-CRISPR/Cas12a反应，可在约1.5 h内输出定量结果。

离心微流控芯片与便携检测设备设计：圆盘芯片由8个径向独立检测模块组成，每个模块包括样品仓、试剂预埋仓、废液仓、3个反应仓、牺牲仓、微通道和通气孔，共形成24个反应仓。牺牲仓吸收过量液体，使每个反应仓体积固定为6.25 μL，并减少毛细管和通道残液造成的交叉污染。加样后，芯片先以1300 rpm离心15 s，使样品进入试剂仓并溶解冻干试剂；再以300 rpm运行15 s，使混合液依靠毛细力进入反应仓。随后在39℃条件下交替执行1000 rpm和500 rpm离心及荧光检测循环，持续60 min。便携设备将离心驱动、温控、470 nm激发、525 nm荧光采集及自动分析集成于一体，并形成“加样即运行”的操作模式。

图 2 ORCMB芯片结构与检测流程：(A) 芯片及单个检测模块的样品仓、废液仓、试剂预埋仓、毛细通道、牺牲仓和反应仓；(B) 聚碳酸酯三层芯片结构；(C) 便携式离心微流控核酸检测设备；(D) 加样、离心分配、39℃一锅法扩增-切割及荧光分析流程；(E) 高速离心复溶试剂和低速离心-毛细驱动分配液体的过程。

一锅法反应的crRNA筛选与关键条件优化：研究首先从3组toxR-RPA引物中筛选出能够产生单一179 bp扩增产物的toxR-RPA-F1/R1。由于Cas12a过快切割会提前消耗RPA扩增产物和引物，而切割过慢又难以形成充分荧光信号，作者比较了经典PAM、亚最优PAM和无PAM位点crRNA。经典PAM使Cas12a快速激活但荧光过早饱和；无PAM体系信号较弱；以CTTG亚最优PAM设计的crRNA适度降低Cas12a活性，为RPA积累扩增产物保留时间窗口，最终获得更高荧光强度和更好的反应稳定性。综合POI时间、荧光强度和成本，报告探针优化为500 nM，Cas12a与crRNA均为100 nM，并以1:1摩尔比加入。

图 3 ORCMB体系的crRNA设计与条件优化：(A) toxR靶区、RPA引物及crRNA识别位点；(B) 3组RPA引物的琼脂糖凝胶筛选结果；(C) 经典PAM、亚最优PAM和无PAM crRNA的荧光动力学及POI比较；(D) 250-2000 nM报告探针浓度优化；(E) 50-400 nM Cas12a/crRNA等摩尔浓度优化。

特异性、灵敏度与冻干试剂稳定性：以副溶血性弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌基因组DNA进行检测时，仅副溶血性弧菌产生明显扩增信号，表明toxR引物和crRNA组合具有良好特异性。标准质粒由6.08×10^6逐级稀释至6.08×10^-1 copies/μL，靶标浓度降低时荧光增强速度减慢、POI时间延长；6.08 copies/μL仍可稳定区别于阴性对照，而3.04和0.608 copies/μL与阴性对照无显著差异，因此确定检测限为6.08 copies/μL。冻干反应试剂在-20℃、4℃和25℃储存1周后，其荧光强度和POI与新鲜试剂无显著差异，支持运输和现场使用。

图 4 ORCMB的特异性与灵敏度：(A) 仅副溶血性弧菌产生显著荧光扩增，其他海洋弧菌及常见食源性病原菌接近阴性对照；(B) 标准质粒浓度降低时荧光信号减弱且POI延后，稳定检测下限为6.08 copies/μL。

运行内标准曲线与定量性能：为使一锅法反应进入可定量状态，研究在固定Cas12a/crRNA浓度的条件下调节RPA引物浓度。200、300和500 nM引物所得标准曲线R2分别为0.9520、0.9734和0.9494，300 nM引物能够在扩增效率与非特异竞争之间取得最佳平衡。芯片预埋10^0-10^4 copies/μL的梯度标准质粒和无模板对照，在样品检测过程中同步获得标准曲线，使温度、试剂批次和运行状态等波动同时作用于标准品与样品，进而降低跨批次外部标准曲线带来的定量偏差。封闭芯片结合体积锁定后，整体定量线性R2大于0.96，可靠定量范围为10^0-10^4 copies/μL。

图 5 不同RPA引物浓度下的荧光动力学与定量标准曲线：(A) 200 nM引物，R2=0.9520；(B) 300 nM引物，R2=0.9734；(C) 500 nM引物，R2=0.9494。300 nM引物在10^0-10^4 copies/μL范围内表现出最佳线性定量能力。

加标海产品与真实养殖样品验证：在虾、鲭鱼和牡蛎加标样品中，ORCMB均可对10^1-10^6 CFU/mL副溶血性弧菌进行梯度检测，且不同食品基质中的结果与qPCR总体一致。低浓度虾样品的qPCR熔解曲线出现非特异扩增，而ORCMB仍保持稳定响应，显示其在复杂基质低丰度检测中的优势。平台在4、25和40℃环境条件下的定量相对误差均控制在±10%以内，批内和批间相对标准偏差为2.63%-6.07%。在50份养殖场真实虾样品中，ORCMB检出21份阳性和29份阴性，qPCR检出20份阳性和30份阴性；阳性一致率和阴性一致率分别为95.24%和100%，灵敏度为100%，特异性为96.67%，ROC曲线AUC达到0.984。全过程阴性对照均无荧光信号，进一步说明封闭芯片能够有效控制交叉污染。

图 6 ORCMB在加标及真实虾样品中的定量性能：(A) 不同浓度加标虾样品的ORCMB扩增曲线；(B) 对应qPCR扩增曲线；(C) 真实虾样品检测的ROC曲线，AUC=0.984；(D) 50份真实样品中ORCMB与qPCR定量结果的热图比较。

3.总结

本文构建的ORCMB平台将运行内标准曲线、一锅法RPA-CRISPR/Cas12a、冻干试剂和封闭式离心微流控有机结合。其核心创新并非单纯追求更高终点荧光，而是利用亚最优PAM-crRNA及引物浓度调控扩增与切割的动力学平衡，使POI与靶标浓度建立稳定线性关系；同时通过体积锁定和同批次校准降低环境变化与批次差异。该平台检测限为6.08 copies/μL，定量范围为10^0-10^4 copies/μL，可在约1.5 h内完成现场定量，单次成本约3.30美元，并在多类海产品及真实养殖样品中表现出接近qPCR的分析性能。

该方法仍存在进一步完善空间。当前样品裂解尚未完全整合到芯片内，富含脂肪和蛋白质的水产基质可能造成堵塞或抑制；toxR核酸检测不能区分活菌与死菌，后续可引入叠氮溴化丙锭等活菌选择性前处理；冻干试剂的长期保存、跨批次定量一致性及复杂环境稳定性仍需系统评价。芯片包含8个独立检测模块，未来可分别预埋针对tdh、trh及其他水产病原菌的引物和crRNA，发展“一次加样、多靶标输出”的现场风险评估平台。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.118327