连接肽优化双价纳米抗体联合光热金脂质体纳米复合物增强双模式侧向流免疫分析

1.引言

侧向流免疫分析具有操作简单、成本较低、便携和响应快速等优势，已广泛应用于食品安全、环境监测和临床诊断。然而，小分子毒素通常采用竞争检测模式，靶标浓度升高会导致检测线信号降低，信号输出有限且依赖肉眼判读，因此其灵敏度和结果可靠性往往低于夹心型免疫分析。提升竞争型LFIA性能需要同时优化抗体识别能力和纳米标签的信号转导效率。

纳米抗体来源于骆驼科动物重链抗体可变区，具有分子量小、结构稳定、易于重组表达和工程化改造等特点。将两个纳米抗体通过柔性肽链串联可形成双价纳米抗体并提高表观结合能力，但连接肽并非简单的结构连接件，其长度会改变两个识别结构域的空间取向、局部柔性及协同作用，进而影响竞争结合行为。另一方面，传统球形胶体金主要依赖可见颜色输出，而具有中空或分支结构的金纳米材料能够通过局域表面等离子体共振产生宽谱近红外吸收和高效光热转换，为建立更灵敏的双模式LFIA提供信号基础。

本研究选择TTX作为模型分析物，构建不同(G4S)n连接肽长度的BvNbs，并结合分子对接、分子动力学模拟和时间依赖ELISA阐明连接肽调控竞争识别的机制；同时以脂质体为软模板合成Au-LNCs，将其作为比色与光热双功能标签，最终建立具有肉眼筛查和红外热成像定量能力的双模式LFIA。

2.结果与讨论

双模式LFIA的总体设计与协同优化思路：该平台包含三部分。首先，将抗TTX纳米抗体Nb9C和Nb7C通过(G4S)2、(G4S)3或(G4S)4连接肽串联，比较不同BvNbs的结合活性、竞争灵敏度和稳定性，并利用分子模拟解释其性能差异。其次，采用卵磷脂和胆固醇制备脂质体，以HAuCl4为金前体、L-抗坏血酸为还原剂，使金在脂质体表面成核和生长，形成具有宽谱近红外吸收的Au-LNCs。最后，将最优BvNb负载到Au-LNCs表面构建探针，并在同一试纸上分别通过检测线颜色和808 nm激光照射后的温升输出比色与光热信号。

图 1 双价纳米抗体-Au-LNCs双模式LFIA总体设计：(A) 通过不同长度(G4S)n连接肽构建BvNbs，并结合分子对接和分子动力学分析连接肽对稳定性、柔性及相互作用的影响；(B) 以脂质体为模板制备具有宽谱近红外吸收和光热转换能力的Au-LNCs；(C) 将最优BvNb与Au-LNCs偶联，用于TTX竞争检测，并分别进行比色判读和808 nm光热读出。

不同连接肽长度双价纳米抗体的构建与筛选：研究从TTX-KLH免疫双峰驼建立的噬菌体展示文库中筛得Nb9C和Nb7C，并将其作为双价构建模块。通过同源重组分别获得BvNb-(G4S)2、BvNb-(G4S)3和BvNb-(G4S)4，纯化后均在约33 kDa处出现单一主要条带，表明重组蛋白成功表达。三种BvNbs的EC50分别降低至5.84×10^-9、1.55×10^-9和1.27×10^-9 mol/L，其中(G4S)4构型具有最强表观结合能力，较两个单价纳米抗体分别提高约22倍和35倍。

值得注意的是，表观结合最强的构型并非竞争检测最优构型。三种BvNbs的IC50分别为300.40、82.76和151.11 ng/mL，BvNb-(G4S)3的IC50最低，并明显优于Nb9C的280.56 ng/mL和Nb7C的429.98 ng/mL。竞争免疫分析不仅需要探针充分结合包被抗原，还需要游离TTX能够有效抑制这一结合；若探针对包被抗原结合过强，反而可能降低竞争抑制效率。因此，作者选择BvNb-(G4S)3作为后续LFIA识别元件。该构型在高温、宽pH范围及较高浓度有机溶剂处理后仍保持优于单价纳米抗体的性能。

图 2 BvNbs的构建与性能分析：(A) Nb9C和Nb7C通过(G4S)2、(G4S)3及(G4S)4连接肽形成双价结构；(B) SDS-PAGE验证BvNbs的表达和纯化；(C) ELISA测定不同构型的结合活性；(D) ic-ELISA比较单价和双价纳米抗体对TTX的竞争灵敏度；(E) 高温、pH、乙腈和甲醇处理后的稳定性。BvNb-(G4S)4表观结合最强，而BvNb-(G4S)3竞争检测性能最佳。

连接肽长度调控竞争识别的结构机制：AlphaFold 2预测和分子对接显示，Nb9C与Nb7C均可在相似结合口袋中识别TTX，二者单价层面的结合方式总体接近，因此双价构型间的性能差异主要与连接肽调控的结构行为有关。三种BvNb-TTX复合物经100 ns分子动力学模拟后均保持整体稳定，回转半径波动小于0.1 nm，说明改变连接肽长度并未破坏双价骨架，而主要影响局部环区和结合相关残基的构象适应性。

氢键分析表明，BvNb-(G4S)2与TTX形成的平均氢键数量最多；相互作用能分析显示，在模拟后20 ns内，BvNb-(G4S)3与TTX具有最大的相互作用能绝对值，而BvNb-(G4S)4总体相互作用较弱。时间依赖ELISA又显示，BvNb-(G4S)4对包被抗原具有更快、更强的表观结合，与其较低EC50和更明显的构象重排一致。综合结果表明，较长连接肽可增强构象适应和包被抗原结合，但过强的固定相结合会削弱游离TTX的竞争作用；中等长度(G4S)3在充分结合和有效竞争之间形成更有利的平衡。

图 3 连接肽长度依赖的分子识别机制：(A、B) Nb9C和Nb7C与TTX的分子对接及结合位点；(C、D) 三种BvNbs的RMSD和回转半径；(E) 残基RMSF反映局部柔性；(F) BvNbs与TTX的氢键数量；(G) 相互作用能随时间变化；(H) 不同连接肽BvNbs的时间依赖ELISA结合曲线。模拟与实验共同说明(G4S)3可获得更适合竞争检测的动力学平衡。

Au-LNCs的制备、结构与光热性能：研究通过薄膜水化形成脂质体纳米囊泡，再以其作为软模板，使金在脂质体表面成核并生长为中空分支状Au-LNCs。TEM和SEM显示材料具有典型三维分支结构，平均粒径约150 nm，明显大于初始脂质体模板的约85 nm；未加入脂质体时仅形成不规则聚集体，说明模板对均匀分支结构的形成至关重要。XPS和EDS结果证实金在脂质体表面成功沉积并具有较均匀的空间分布。

传统球形AuNPs在约520 nm处具有窄吸收峰，而Au-LNCs的吸收带从可见区延伸至近红外区。808 nm激光照射下，Au-LNCs表现出明显的时间和浓度依赖升温，低浓度分散液也可产生约30℃温升；多次加热-冷却循环后光热性能无明显衰减。根据冷却曲线计算，其光热转换效率达到78.06%，说明中空分支结构能够增强等离子体耦合和光能捕获，为试纸膜上光热放大提供稳定标签。

图 4 Au-LNCs的结构与光热性能：(A) 脂质体模板法合成路线；(B、C) TEM、SEM及粒径分布显示中空分支结构；(D) XPS元素分析；(E) Au-LNCs、AuNPs和脂质体的吸收光谱；(F) 不同浓度Au-LNCs在808 nm照射下的升温曲线；(G) 冷却过程拟合及78.06%的光热转换效率；(H) 不同浓度样品的红外热图。

比色-光热双模式LFIA构建与信号原理：Au-LNCs表面带约-28 mV负电荷，负载BvNb后电位转变为约+4 mV，结合上清中未偶联BvNb减少的结果，证明纳米抗体可通过静电驱动组装到Au-LNCs表面。试纸采用竞争模式：样品中的TTX先与Au-LNCs-BvNb探针结合，未被游离TTX占据的探针在层析过程中被T线上的TTX-BSA捕获。随着TTX浓度升高，T线捕获的Au-LNCs减少，灰蓝色条带和光热温升同步降低；C线由二抗捕获探针，用于判断试纸是否有效。

Au-LNCs被固定在硝酸纤维素膜后仍可在808 nm近红外照射下产生明显温升。与比色输出相比，光热读出在液相中的最低可检测浓度降低4倍，在固相膜上的最低可检测浓度降低2倍，说明Au-LNCs不仅在溶液中具有高效光热转换能力，也能在试纸捕获状态下保持较强热信号，从而为低浓度靶标提供更大的可分辨信号差异。

图 5 双模式LFIA的构建与信号表征：(A) 竞争型比色和光热检测原理；(B) Au-LNCs负载BvNb前后的Zeta电位变化；(C、D) Au-LNCs在液态和膜上固态条件下的升温曲线及浓度响应；(E) 不同浓度材料在液相和固相中的比色及红外热成像结果。

双模式LFIA的分析性能与特异性：优化探针用量、T/C线包被浓度、缓冲液和检测时间后，比色模式中T线强度随TTX浓度升高逐渐降低，检测限为5.31 ng/mL，线性工作范围为14.26-417.32 ng/mL，IC50为77.14 ng/mL。光热模式以T线最终温度与初始温度之差ΔT作为信号，其检测限为1.89 ng/mL，约为比色模式的1/2.8。以相同BvNb构建的传统AuNPs-LFIA检测限为20.43 ng/mL，因此Au-LNCs比色模式和光热模式的灵敏度分别提高约3.9倍和10.7倍。

在400 μg/mL高浓度条件下，结构相关毒素石房蛤毒素（STX）、膝沟藻毒素（GTX-1,4）以及非相关微囊藻毒素-LR均未产生明显TTX阳性响应，表明该平台具有良好选择性。加速储存实验中试纸抑制率总体稳定，未观察到明显性能损失，支持其作为现场快速筛查工具的应用潜力。

图 6 TTX双模式LFIA的分析性能：(A) 比色模式试纸图像和标准曲线，LOD为5.31 ng/mL；(B) 光热模式红外图像和ΔT标准曲线，LOD为1.89 ng/mL；(C) TTX与STX、GTX及MC-LR的特异性比较；(D) Au-LNCs光热、Au-LNCs比色和传统AuNPs-LFIA分析参数对比。

河豚鱼与海星样品中的实际应用：研究依据GB 5009.206-2016对河豚鱼肌肉和海星卵进行提取，并设置200、500和1000 ng/g三个TTX加标水平。河豚鱼样品中，比色模式回收率为78.9%-97.4%，光热模式为70.5%-81.3%；海星样品中，比色模式为90.1%-111.4%，光热模式为81.3%-120.4%。两种LFIA模式的变异系数均不超过10.2%，表现出可接受的重复性。GC-MS/MS对照结果与双模式LFIA总体趋势一致，证明该方法能够用于复杂水产品基质中的快速筛查和半定量分析。

部分基质和加标水平的回收率仍明显偏离100%，例如河豚鱼500 ng/g样品的光热回收率为70.5%，海星200 ng/g样品为120.4%，提示不同水产品基质对竞争结合、层析迁移或热信号读出仍存在影响。后续可通过基质匹配校准、提取净化和样品稀释策略进一步改善定量准确度。

表 1 河豚鱼肌肉和海星卵中TTX的加标回收结果：比较比色模式（CM）、光热模式（PT）与GC-MS/MS在200、500和1000 ng/g加标水平下的测定浓度、回收率和变异系数。

3.总结

本文建立了“连接肽优化识别元件+高效光热信号标签”的协同增强策略。双价化显著提高了纳米抗体的表观结合能力，但研究进一步证明，竞争型免疫分析并非结合越强越好；BvNb-(G4S)3通过适中的连接肽长度，在局部柔性、游离TTX相互作用和包被抗原结合之间取得平衡，从而获得最佳竞争灵敏度。脂质体模板制备的中空分支状Au-LNCs则兼具可见颜色、宽谱近红外吸收和78.06%的光热转换效率，使同一试纸可完成快速比色筛查和更灵敏的光热定量。

最终平台的比色和光热检测限分别为5.31和1.89 ng/mL，光热模式较传统胶体金LFIA提高约10.7倍，并在河豚鱼和海星样品中表现出可接受的准确度和重复性。与HPLC-MS/MS或部分电化学免疫传感器相比，该方法的极限灵敏度仍有差距，且光热读出需要808 nm激光和红外热成像设备；此外，连接肽优化规律目前仅在TTX-纳米抗体体系中得到验证，其对其他小分子毒素和不同纳米抗体组合的普适性仍需进一步研究。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2026.119015