基于噬菌体-点击化学荧光生物传感平台的纳米架构用于荧光假单胞菌检测

1.引言

荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）是乳制品中常见的嗜冷腐败菌，可在低温储藏条件下生长，并分泌耐热蛋白酶和脂肪酶，导致乳蛋白和脂质降解。传统培养法通常需要24-72 h，且低菌量条件下灵敏度有限；PCR虽然提高了检测效率，但仍依赖仪器、引物设计和核酸提取。因此，建立快速、灵敏并适用于复杂乳基质的检测方法具有重要意义。

噬菌体能够特异识别活细菌宿主，具有成本低、易修饰和选择性高等优势；与此同时，Cu(I)催化的叠氮-炔环加成（CuAAC）反应具有反应条件温和、选择性高和信号放大能力强等特点。本研究将噬菌体识别、磁性富集与人工点击酶催化相结合，构建了“捕获-识别-催化放大”的荧光检测体系，以提高荧光假单胞菌在乳制品中的检测灵敏度和可靠性。

2.结果与讨论

CCRN@Phage识别探针与磁性富集-点击催化检测原理：研究首先以CuSO4和Cys-RGD为原料，经水热反应制备Cu(I)富集的CCRN，并通过EDC/NHS偶联将荧光假单胞菌噬菌体连接到CCRN表面，形成CCRN@Phage特异识别探针。检测时，ConA@Fe3O4首先通过识别细菌表面糖基对目标菌进行磁性富集，随后CCRN@Phage结合目标菌形成夹心复合物。磁分离后，复合物上的CCRN直接催化叠氮化物与炔醇发生CuAAC反应，生成具有强荧光的三唑产物，从而把细菌数量转化为可定量的荧光信号。

图 1 CCRN点击酶的制备、CCRN@Phage识别探针组装及荧光假单胞菌检测原理。

Cu(I)富集CCRN点击酶的结构与组成表征：CCRN整体呈近球形，平均粒径约250 nm，元素分析显示Cu、O、N和S在材料中分布均匀。XRD结果表明其具有无定形结构，而XPS和Cu LMM Auger谱进一步确认材料同时含有Cu(I)和Cu(II)，其中Cu(I)比例约为87%。较高的Cu(I)含量使CCRN无需酸溶或外加还原剂即可直接进行CuAAC催化；同时，Cys-RGD配体中的羧基、酰胺和含硫基团既有助于稳定Cu(I)，也为后续噬菌体偶联提供了反应位点。

图 2 CCRN点击酶的形貌、元素分布、晶体结构及XPS/Auger价态表征。

分析性能及乳制品基质验证：在395 nm激发下，CuAAC反应生成的三唑产物在约475 nm处产生荧光，且信号随荧光假单胞菌浓度升高而增强。优化后方法的检测限为1 CFU/mL，线性响应范围为10²-10⁷ CFU/mL，对多种非目标食源性细菌未出现明显交叉反应。进一步在生乳、UHT乳和巴氏乳中进行加标验证，各类样品的平均回收率约为97.8%-102.9%，说明磁性富集和噬菌体识别能够有效降低乳基质干扰并维持稳定信号。

图 3 CCRN点击酶荧光检测体系的工作流程、灵敏度、线性范围、特异性及探针储藏稳定性。

3.总结

本研究通过将ConA@Fe3O4磁性富集、噬菌体特异识别和Cu(I)富集CCRN的CuAAC催化放大整合到同一检测体系，实现了荧光假单胞菌的高灵敏荧光检测。该策略避免了传统Cu基催化体系对酸溶或外加还原剂的依赖，并在多种乳制品基质中保持较好的准确性和抗干扰能力。当前体系仍主要在实验室条件下完成验证，后续可进一步扩展至更多食品基质，并向多重检测、便携化和自动化现场检测方向发展。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2026.118406