0.14 ng/mL检出伏马毒素B1：ESDR/DNAzyme比色传感器用于谷物快速筛查

伏马毒素是由镰刀菌等真菌产生的一类真菌毒素，容易污染玉米及其制品等谷物食品。其中，伏马毒素B1是毒性贡献较大的组分，具有潜在致癌、致畸、生殖毒性和肝毒性风险。由于谷物及谷物制品消费范围广，面向食品安全监管和生产现场，建立灵敏、低成本、易操作的伏马毒素B1检测方法具有实际意义。传统检测通常依赖高效液相色谱、酶联免疫分析或液相色谱-串联质谱等技术，这些方法准确度高，但往往需要大型仪器、专业操作和相对复杂的样品处理，不利于资源有限场景下的快速初筛。

围绕这一需求，本研究设计了一种ESDR/DNAzyme信号级联放大的比色适配体传感器。其核心思路是让伏马毒素B1先与适配体发生特异性结合，释放可触发后续反应的tDNA；随后，tDNA启动熵驱动链置换反应，产生能够参与DNAzyme切割的信号链。被释放的DNAzyme进一步切割带有核糖腺苷位点的发夹底物，使G-四链体片段暴露并与hemin结合，形成具有类过氧化物酶活性的复合物。该复合物催化H2O2氧化ABTS，使溶液由浅绿色向深绿色变化，从而把微量目标分子的识别转化为肉眼可见或仪器可读的比色信号。

图1. ESDR/DNAzyme信号级联放大比色适配体传感器检测谷物食品中伏马毒素B1的原理示意图。

为了验证传感逻辑是否按预期运行，研究团队首先利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析ESDR体系和DNAzyme切割过程。在存在伏马毒素B1时，适配体-互补链复合物释放tDNA，ESDR反应被触发，并形成对应的长双链产物和释放链；缺少伏马毒素B1时，tDNA仍被锁定在适配体复合物中，后续放大过程难以启动。DNAzyme模块同样表现出条件依赖性：在Mg2+存在时，底物发夹被切割并释放后续显色所需片段，而缺少Mg2+时切割反应不明显。吸光度扫描进一步显示，加入伏马毒素B1后体系在420 nm附近产生更高吸收，溶液颜色也出现可辨识变化，说明目标识别、核酸放大与显色输出之间可以形成连续响应。

图2. 不同分析条件的优化结果：（A）F链浓度；（B）ESDR反应温度；（C）ESDR反应时间；（D）Mg2+加入量；（E）发夹H浓度；（F）DNAzyme切割时间；（G）hemin孵育时间；（H）hemin加入量；（I）ABTS加入量。误差线表示三次平行实验的标准差。

在参数优化中，研究围绕F链浓度、ESDR反应温度和时间、Mg2+加入量、发夹底物浓度、DNAzyme切割时间、hemin孵育时间及ABTS用量等因素逐一调整。结果显示，F链浓度为1.5 μM、ESDR反应温度为37 °C、ESDR反应时间为45 min时，体系响应较优；DNAzyme切割模块中，Mg2+加入量、发夹H浓度和切割时间也会明显影响信号输出，其中发夹H浓度优化为1.5 μM，切割时间约60 min后趋于稳定。hemin与G-四链体结构结合后提供类过氧化物酶活性，因此hemin孵育时间和加入量决定显色效率；最终体系通过这些条件组合获得较稳定的颜色和吸光度变化。

在定量性能方面，本研究设置了两种读数模式。第一种是面向现场使用的手机读数：研究者用手机应用提取反应液中心区域的颜色信息，并以绿色通道与红色通道的比值进行分析。随着伏马毒素B1浓度升高，溶液颜色逐渐加深，在5-100 ng/mL范围内，颜色比值与目标浓度对数呈较好线性关系，线性方程为G/R=1.514LgCFB1+0.3808，相关系数R2为0.9904，检出限为4.275 ng/mL。研究同时指出，手机摄像头并非专用定量检测器件，颜色响应会受到光源、相机传感器和白平衡等因素影响，因此该模式更适合即时筛查和初步判断。

第二种是以多功能酶标仪测量吸光度。随着伏马毒素B1浓度升高，体系吸光度逐步增强，在0.2-100 ng/mL范围内呈现清晰的浓度依赖关系。以目标浓度对数为横坐标、A/A0为纵坐标时，线性方程为A/A0=0.6282LgCFB1+1.575，相关系数R2达到0.9935，检出限为0.14 ng/mL。与手机读数相比，吸光度模式对微弱颜色变化的解析能力更强，更适合实验室或半现场条件下的准确定量。两种模式的组合，使该传感器既保留了便携筛查的可能，也提供了更可靠的定量读数路径。

图3. 伏马毒素B1检测性能：（A）不同FB1浓度下手机识别的颜色强度变化；（B）G/R值与FB1浓度对数的线性关系；（C）不同FB1浓度下反应体系的吸光度响应；（D）A/A0值与FB1浓度对数的线性关系。

特异性测试中，研究选择了谷物中常见的多种真菌毒素作为干扰物，包括黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、T-2毒素和伏马毒素B2。结果显示，单独干扰物及混合干扰物产生的吸光度接近空白组，颜色变化较弱；只有含有伏马毒素B1的样品组产生明显增强的吸光度和深绿色显色。该结果说明，适配体识别和后续级联放大并未被这些高浓度干扰毒素明显触发，体系对伏马毒素B1具有较好的选择性。重复性方面，7组相同反应体系的吸光度输出较稳定，相对标准偏差为2.996%，提示该检测流程在重复操作中具有一定一致性。

图4. 传感器的特异性和重复性评价：（A）FB1及常见谷物真菌毒素干扰物条件下的特异性测试；（B）7组平行体系的重复性测试。

为了进一步考察复杂基质中的实用性，研究在玉米、婴幼儿玉米片和牛奶样品中进行了伏马毒素B1加标回收实验，并将结果与HPLC-MS/MS进行比较。手机辅助方法的回收率为89.9%-112.88%，相对标准偏差为2.51%-9.95%；吸光度比色适配体传感器的回收率为91.65%-108.5%，相对标准偏差为1.22%-9.36%；HPLC-MS/MS的回收率为93.8%-109%。三种方法的回收区间高度重叠，说明该传感器在复杂食品样品中具有可接受的准确性和稳定性。

总体来看，本研究的价值不在于完全替代实验室确证方法，而在于把核酸适配体识别、ESDR循环放大、DNAzyme切割和比色读数整合为一个相对低成本的平台。对于基层检测、企业原料筛查或资源有限地区，该方法可作为伏马毒素B1快速初筛的候选工具；对于需要严格定量和合规判定的场景，仍需结合标准仪器方法进行复核。后续若要进一步走向应用，还需要围绕样品前处理简化、手机读数标准化、批间一致性和现场环境适应性开展更多验证。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2026.148774