自动化集成实时监测平台助力高效菌株筛选

在益生菌发酵生产阶段，菌体浓度和生理活性的实时跟踪，是工业生物制造比较棘手的问题；传统离线检测手段包含紫外分光光度测试、平板计数等方法，这类操作费时费力，需要人工取样，还存在样品污染风险，也无法区分活菌与死菌，很难满足持续在线监测的实际需要；SPR 技术虽可以实现实时检测，但受穿透深度限制，不适用于微米级微生物样本；为此，本研究需要开发一套非侵入式，能够实时采集多维度信息的微生物生长监测手段。

本试验把 MetaSPR 纳米芯片、96 孔板和自动移液工作站相互组合，搭建无标记的微生物多状态监测平台；平台可连续 48 h 记录菌株生长情况，省去人工取样步骤，同步调试培养与冻干保护条件，大幅缩短试验周期；通过对芯片修饰改性，实现菌株活性与革兰氏菌种类型区分；配套开发移动 PAT 设备适配发酵罐原位检测，服务益生菌发酵管控和工业线上质检工作。

图1。连续微生物生长监测平台的示意图。（a）微生物密度监测芯片传感器;（b）高通量筛选芯片传感器;（c）连续微生物生长监测示意图。

研究内容：

MetaSPR芯片的设计与特性分析：制备了三种纳米杯阵列MetaSPR芯片（底部直径180、200、220 nm）。SEM确认结构均匀。蔗糖溶液折射率测试显示，RI增大，光谱红移且响应增强。220 nm芯片灵敏度最优，比Structure 1提高2倍，为微生物检测提供了高性能传感基底。

图2。MetaSPR芯片的设计与特性分析。（a） MetaSPR芯片的制造工艺。（b） MetaSPR芯片上纳米结构阵列的SEM图像，纳米杯底部直径分别为180 nm、200 nm和220 nm。（c-e）分别是结构1、结构2和结构3芯片的SPR光谱，展示了折射率变化（n=3）引起的红移现象。这些面板还包括芯片的归一化光谱偏移数据，以及描绘折射率变化与光学密度关系的图表和拟合曲线。

构建微生物实时监测模型：通过Protein A-IgG验证芯片分子识别能力，Structure 3响应最强。将芯片固定于96孔板，对BLa80梯度稀释检测，结果与传统OD600法高度相关（R²=0.9987），证实MetaSPR芯片在微生物定量检测中的可行性和准确性。

图3。MetaSPR平台的建设。（a）用于评估MetaSPR芯片通过ProA-IgG结合监测分子相互作用能力的评估流程示意图。（B-D）三种结构芯片类型（n=4）的归一化光谱偏移数据，分子相互作用与光学密度的关系图，以及相应的拟合曲线。（e） 利用MetaSPR芯片传感器检测串行稀释细菌培养密度（OD）（n=3）。（f） 使用传统方法（n = 3）检测连续稀释细菌培养密度（OD）。（g） 比较两种方法的一致性分析（R²= 0.9987）。

自动集成检测平台的系统配置：自动化移液工作站，配备96通道移液头和XYZ三轴模块（精度≤0.1 mm），支持多模式运行与中文编程界面。采用2×3板位布局，集成清洗与防漏设计，实现多板并行处理，消除人为误差，保障零样本损失。

图4。自动集成检测平台的系统配置。（a） 自动移液工作站的示意图;（b）主要操作与控制接口;（c） 系统参数设置接口;（d） 手动轴控制接口;（e） 程序设置界面;（f） 移液管安装过程包括连接移液器尖端、吸入液体、分配液体、同时分配多个孔板的液体，以及丢弃移液器尖端;（g）下降模式的吸入和混合。

通过平台实现的连续微生物生长曲线监测：利用集成平台对BLa80进行48 h连续监测（每10 min/次），自动获取完整生长曲线，与手动取样法高度一致。同步筛选不同培养基与接种量组合，清晰呈现各条件生长差异，验证了平台在高通量培养条件优化中的效率。

图5。利用自动化集成检测平台对微生物进行持续监测。（a）连续微生物监测的示意图。（b）传统抽样方法检测到的微生物生长曲线（n=3）。（c） 通过MetaSPR芯片采样检测的微生物生长曲线（n = 3）。（d） 传统方法和MetaSPR芯片检测结果的一致性。（e） 当BLa80细菌溶液（OD = 0.1）分别以1%、5%和10%接种量接种到MRS和LB培养基时，各组BLa80的生长状态（n=3）。（f） 当BLa80细菌溶液（以1%剂量接种于OD = 0.1细菌溶液，培养12小时）分别以1%、5%和10%接种剂粒度重新接种到MRS和LB培养基时，各组BLa80的生长状态（n=3）。（g） 当细菌溶液（OD = 0.1及培养12小时）分别以1%、5%和10%接种量接种到MRS培养基时，各组BLa80的生长状态（n=3）。在这些图表中，灰色、蓝色和紫色曲线代表在初始光学密度0.1处接种细菌悬浮液的组别，而红色、绿色和黄色曲线则表示培养12小时后接种细菌悬浮液的组别。

基于平台的微生物活动检测：TLR2蛋白功能化芯片特异性识别革兰氏阳性菌，LPS抗体芯片识别革兰氏阴性菌。活性实验显示，正常活菌结合信号显著强于低活性菌，信号与活性正相关。BSA及脱脂奶粉干扰下特异性良好，验证了芯片的抗干扰能力与活性区分可靠性。

图6。MetaSPR多模态平台的应用。（a） 使用功能化MetaSPR芯片搭配TLR2检测微生物的示意图。（b）微生物活动检测。正常活性组通过接种并培养细菌悬浮液，培养过夜孵育12小时获得，低活性组则通过接种并培养长期储存在4°C的细菌悬浮液。（c） 正常活性微生物与TLR2蛋白之间的亲和力检测（n = 3）。每条曲线代表不同的CFU浓度，表示为×10⁸CFU/毫升。（d） 低活性微生物与TLR2蛋白之间的亲和力检测（n=3）。每条曲线代表不同的CFU浓度，表示为×10⁸CFU/毫升。（例如）BLa80（n = 3）冻保护条件的优化。缩写：Tre，trehalose;蔗糖;甘油;SMP，脱脂奶粉。（h） 利用微孔板平台检测串行稀释的12小时细菌溶液，并用于生成标准曲线。图中的曲线按升序排列：MRS介质，细菌悬浮液稀释因子为64、32、16、8、4、2和0。（i）由微孔板平台检测的标准曲线。（j） BLa80接种后12小时监测的检测结果（n = 3）。

结论：

本试验搭建一套以 MetaSPR 纳米芯片为核心的自动化实时监测平台，可对益生菌发酵过程的菌体密度、生理活性，实现无标记、连续的批量在线检测；平台将纳米杯阵列 MetaSPR 芯片、96 孔板与自动移液工作站组合，依靠折射率变化带来的透射信号改变，48 h 内自动得到菌株生长曲线，不用人工取样，把培养、冻干保护条件调试周期从数周缩短到数小时；通过蛋白与抗体修饰芯片，完成活菌活性区分以及革兰氏菌种鉴别；和平板计数法对比，检测结果一致性较好，R²=0.9987；即便存在 BSA、脱脂奶粉等干扰物，芯片特异性依旧良好；该平台可为益生菌发酵控制、工业化在线质检提供可行的检测方案。

论文链接：10.1016/j.foodchem.2026.150025