基于CRISPR/Cas13a、核酸酶辅助循环扩增与侧向层析的口腔病原菌高灵敏便携检测

1.引言

口腔病原菌与多种口腔及全身性疾病密切相关，快速鉴定病原体有助于早期干预和精准治疗。传统形态学观察灵敏度较低，培养法虽然可靠但耗时较长，抗原或抗体检测可能受到成本、稳定性和交叉反应影响，而PCR等分子方法通常依赖严格的实验条件和专业设备，因此难以同时满足高灵敏、快速和现场检测需求。

细菌细胞中含有大量核糖体及16S rRNA，其种间差异可用于病原菌鉴别。Cas13a能够直接识别RNA，无需先进行逆转录，并具有可编程和快速响应的特点。为进一步放大识别信号，该研究将Cas13a与T7外切核酸酶介导的等温循环扩增结合，以口腔链球菌为模型建立CRIE体系，并拓展出荧光、紫外-可见比色和侧向层析三种读出方式。

2.结果与讨论

CRIE检测体系的总体设计与多信号输出：目标口腔链球菌16S rRNA首先激活CRISPR/Cas13a并启动核酸探针反应，随后由T7外切核酸酶辅助完成两级循环放大。放大产物可分别驱动FAM和Cy5荧光恢复，也可形成G4结构并与hemin结合，催化多巴胺聚合为深色聚多巴胺。由此，同一分子识别过程能够输出荧光、紫外-可见吸收和试纸条可视信号，兼顾实验室定量和现场筛查。

图 1 CRIE体系用于口腔链球菌16S rRNA检测的总体设计。目标RNA经CRISPR/Cas13a识别后触发发卡探针和T7外切核酸酶辅助循环扩增，最终通过荧光、紫外-可见吸收及CRIEC侧向层析试纸完成信号读取。

CRISPR/Cas13a触发的双级酶循环扩增与凝胶验证：Cas13a识别16S rRNA后切割HP1并释放ssDNA1，ssDNA1与HP2杂交形成T7外切核酸酶底物；酶切后释放ssDNA2，同时使ssDNA1进入下一轮反应。随后，ssDNA2与双链DNA探针发生链置换并释放ssDNA3，T7外切核酸酶再次切割新形成的双链结构，使ssDNA2循环利用。原位PAGE结果依次验证了靶标结合、HP1切割、ssDNA1/HP2复合物形成、链置换和ssDNA3释放，说明两级循环扩增能够按照设计连续运行。

图 2 CRIE的设计原理及凝胶电泳验证。(A) 口腔链球菌16S rRNA激活CRISPR/Cas13a，随后通过HP1、HP2、双链DNA和T7外切核酸酶完成两级循环扩增；(B) 原位PAGE条带验证靶标识别、探针切割、复合物形成、链置换以及最终输出链释放过程。

荧光动力学与16S rRNA检测灵敏度：研究在HP1两端引入FAM和淬灭基团，并在双链DNA探针中设置Cy5信号。加入靶标后，FAM信号约在10 min开始恢复并于26 min达到峰值，反映Cas13a对HP1的切割；Cy5信号约在23 min后明显增强并于52 min达到峰值，表征T7外切核酸酶辅助循环扩增。缺少目标RNA、Cas13a或T7外切核酸酶时均不能产生显著信号。随着靶序列浓度升高，两种荧光同步增强，CRIE对16S rRNA的检测限为3.38 nM，明显低于单独Cas13a识别体系的56.23 nM。

图 3 荧光分析验证CRIE反应及其灵敏度。(A) FAM与Cy5信号随反应时间的变化；(B) 目标RNA、CRISPR/Cas13a和T7外切核酸酶缺失或同时存在时的荧光响应；(C) 不同浓度16S rRNA产生的荧光光谱；(D) CRIE与单独CRISPR/Cas13a体系的线性关系和检测性能比较。

序列特异性与口腔链球菌样本检测：错配实验表明，CRIE能够识别含两个及以上碱基错配的非目标序列。以金黄色葡萄球菌、乳酸杆菌、奈瑟菌、白色念珠菌和大肠杆菌的16S rRNA作为对照时，只有口腔链球菌靶标产生明显荧光；多种非目标微生物共同存在也未显著影响目标信号。在经TRIzol处理的加标样本中，荧光强度在10²-10⁷ CFU/mL范围内随口腔链球菌浓度增加而升高，检测限达到20.23 CFU/mL，显示该体系具备在复杂生物样品中进行高灵敏检测的潜力。

图 4 CRIE检测口腔链球菌16S rRNA的选择性和样本分析。(A) 对含2-5个碱基错配序列的区分能力；(B) 不同口腔及非口腔微生物靶标和混合干扰条件下的荧光响应；(C) 不同浓度口腔链球菌的荧光光谱；(D) 荧光强度与细菌浓度对数之间的线性关系。

G4/hemin催化聚多巴胺的比色检测：研究将循环扩增产生的ssDNA3设计为G-四链体序列，其与hemin结合后形成具有催化活性的G4/hemin复合物，并促进多巴胺快速聚合生成有色聚多巴胺。只有目标16S rRNA、Cas13a和T7外切核酸酶同时存在时，溶液才出现明显颜色和490 nm附近吸收变化。随着口腔链球菌浓度增加，颜色逐渐加深，吸光度在10³-10⁷ CFU/mL范围内呈线性变化，比色检测限为459.23 CFU/mL。该方法无需荧光标记，可降低读出设备和试剂成本。

图 5 CRIE的紫外-可见吸收与比色双读出。(A) 目标16S rRNA存在或缺失时的吸收光谱及溶液颜色；(B) 不同浓度口腔链球菌产生的颜色和吸收变化；(C) 峰值吸光度与口腔链球菌浓度对数之间的线性关系。

CRIE集成侧向层析试纸的便携检测：为简化操作，研究进一步构建了CRIEC试纸条，主要由样品垫、信号探针区域、硝酸纤维素膜和吸水垫组成。样品与G4/hemin反应物加入后，经恒温孵育和层析迁移，在T区催化多巴胺沉积形成黑色聚多巴胺条带，检测过程仅包括加样、恒温反应和肉眼判读三个步骤。空白样品不出现条带，而口腔链球菌阳性样品形成明显黑带；金黄色葡萄球菌、乳酸杆菌和奈瑟菌对照不产生阳性信号。试纸条可检测10³-5×10⁵ CFU/mL的口腔链球菌，为无需专用仪器的便携检测提供了基础。

图 6 CRIE集成侧向层析试纸用于口腔链球菌检测。(A) CRIEC试纸结构；(B) G4/hemin催化多巴胺在T区沉积聚多巴胺的操作流程；(C) 阳性和阴性样品的颜色响应；(D) 不同微生物对照的特异性；(E) 不同浓度口腔链球菌的试纸条信号。

3.总结

该研究建立了由CRISPR/Cas13a特异性识别、T7外切核酸酶双级循环扩增和多模式信号读出组成的口腔病原菌检测平台。CRIE通过连续循环利用ssDNA1和ssDNA2，将一次RNA识别事件转化为大量ssDNA3输出，使16S rRNA检测限降低至3.38 nM，并实现20.23 CFU/mL水平的口腔链球菌荧光检测。进一步利用G4/hemin催化聚多巴胺反应，体系获得无需复杂标记的可视比色信号；与侧向层析试纸结合后，可通过简单加样、恒温孵育和肉眼观察完成约10³ CFU/mL水平的便携检测。该方法兼具RNA靶向特异性、等温信号放大和多种读出选择，为低丰度口腔病原菌的快速筛查提供了新思路。现有验证主要集中于口腔链球菌模型和加标样品，后续仍需在更多临床口腔样本、不同菌株及批次化试纸中评估稳定性、重复性和实际诊断性能。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2026.118935