从试纸显色到定量读数，级联侧向层析提升农残检测灵敏度

水果、蔬菜和药食同源草本在种植和流通过程中都可能接触农药。传统气相色谱、液相色谱以及质谱方法能够提供准确结果，但通常需要较长的前处理时间、较大的仪器和专业操作人员。相比之下，侧向层析免疫分析具有成本低、操作简单、结果直观和便于携带等特点，已经被用于现场检测病原体和化学污染物。不过，普通侧向层析主要依靠试纸条上的显色信号，检测灵敏度和定量能力往往难以同时满足要求。

本研究从两个环节改进这一检测路线。第一步是在传统免疫识别基础上加入级联抗体系统，让胶体金颗粒携带更多能够参与信号放大的组分；第二步则使用带有硼酸基团的长寿命铱(III)发光探针，对试纸条上胶体金信号进行二次读出。研究人员将两步过程分开：农药先在试纸条上完成识别和富集，随后再把检测线区域的胶体金洗脱出来，与Ir-PIPB反应并测量发光信号。这样做既保留了侧向层析的便携特点，也把原本较难定量的显色结果转化为可分析的发光信号。

图1. 采用级联侧向层析和硼酸功能化长寿命铱(III)探针进行农药残留灵敏、定量检测的CS-LFIA/Ir-PIPB策略示意图。

级联体系的核心是对胶体金标记方式的重新组织。普通胶体金颗粒在试纸上迁移后，会按照抗原抗体反应被捕获在检测线和质控线上；在新的体系中，胶体金同时携带农药抗体和级联识别抗体，并通过另一组抗原抗体配对形成较大的级联胶体金复合物。透射电镜观察到，普通胶体金颗粒平均直径约为17 nm，而级联后颗粒的整体尺寸增加到约52–127 nm。点印迹结果显示，农药抗体和级联识别抗体的负载效率分别为60.4%和26.68%。这些变化为后续的信号增强提供了颗粒基础。

图2. CS-LFIA农药残留检测策略的条件优化。（A）级联胶体金增强、生物亲和引导的CS-LFIA检测农药残留示意图；（B）胶体金和级联胶体金的代表性透射电镜图像；（C）利用点印迹实验评价胶体金上农药特异性抗体和级联识别抗体的负载效率；（D）有无氟虫腈条件下不同pH的CS-LFIA代表性图像及相对显色强度；（E）有无氟虫腈条件下使用不同浓度氟虫腈抗体的CS-LFIA代表性图像及相对显色强度；（F）有无氟虫腈条件下使用不同浓度氟虫腈抗原的CS-LFIA代表性图像及相对显色强度；（G）有无氟虫腈条件下，使用不同量莱克多巴胺抗体的CS-LFIA代表性图像；（H）左：不同莱克多巴胺抗体水平和有无氟虫腈条件下的检测线信号热图；右：不同莱克多巴胺抗体水平下有无0.15 ng/mL氟虫腈时的CS-LFIA信号强度比。数据以均值±标准差表示。

在三种草本基质中，级联侧向层析能够检测加标的氟虫腈，测试浓度范围为0.05–0.5 ng/mL。研究还用有机磷杀虫剂毒死蜱考察了体系的适用范围。与没有级联组分的对照体系相比，加入莱克多巴胺抗体和抗原后，纯溶剂以及鸡蛋花样品中的检测信号差异更加明显。这个结果说明，级联信号放大不局限于单一农药，而是有机会作为侧向层析平台的通用增强环节。

为了实现定量检测，研究团队合成了带硼酸基团的长寿命铱(III)探针Ir-PIPB。胶体金能够通过表面等离子体吸收以及距离依赖的能量转移过程淬灭Ir-PIPB的发光；当试纸条上的胶体金数量随农药浓度发生变化时，洗脱液中的发光信号也随之改变。对氟虫腈而言，体系在线性范围0.0231–0.5 ng/mL内响应良好，检出限为0.007 ng/mL。对吡虫啉的检测范围为0.898–20 ng/mL，检出限为0.269 ng/mL。两种农药分别通过检测线或质控线信号变化进行判断，说明该方法能够将侧向层析中的位置差异转化为定量信息。

图3. CS-LFIA/Ir-PIPB体系的定量检测。（A）硼酸功能化长寿命铱(III)探针Ir-PIPB的合成路线，以及Ir-PIPB与胶体金相互作用示意图；（B）在50 μM Ir-PIPB存在下、不同氟虫腈浓度对应的检测线荧光光谱和紫外图像；右：不同氟虫腈浓度下检测线570 nm处的发光强度；（C）在50 μM Ir-PIPB存在下、不同氟虫腈浓度对应的质控线荧光光谱和紫外图像；（D）在50 μM Ir-PIPB存在下、不同吡虫啉浓度对应的检测线荧光光谱和紫外图像；右：不同吡虫啉浓度下检测线570 nm处的发光强度；（E）不同吡虫啉浓度对应的质控线荧光光谱和紫外图像。

真实样品验证中，研究人员以鸡蛋花样品为基质，将CS-LFIA/Ir-PIPB体系与高效液相色谱进行了比较。两种方法得到的结果具有较强线性相关，相关系数R²为0.9535，说明该平台在这一草本样品中能够给出与标准方法接近的结果。需要注意的是，论文中的样品为加标样品，主要用于验证方法的回收和定量能力，并不等于对市场样品中天然残留水平的调查。

研究还重点考察了背景干扰。胶体金发生热诱导聚集后，粒径由约50 nm增大到约220 nm，但Ir-PIPB仍能对其产生相近的发光响应，说明体系对胶体金聚集具有一定耐受性。铱(III)配合物的长寿命发光则为时间分辨检测提供了条件，可以通过延迟采集信号的方式削弱短寿命的背景荧光。在含有香豆素干扰物的鸡蛋花样品中，吡虫啉信号与空白信号的比值在100–110 ns附近达到峰值；在100 ns延迟时间下，信号与空白的比值由0 ns时约4提高到12.36。

图4. CS-LFIA/Ir-PIPB体系抗干扰性能与农药残留灵敏检测。（A）标准胶体金和热处理胶体金的Zeta平均值；（B）50 μM Ir-PIPB存在下标准胶体金和热处理胶体金的发光光谱；（C）利用铱(III)长寿命信号抑制干扰的示意图；（D）含100 μM香豆素干扰物的鸡蛋花样品中，吡虫啉的时间分辨发光信号在570 nm处的信号/空白比值；（E）含50 nM吡虫啉样品相对于空白的检测线时间分辨发光信号在570 nm处的变化，检测中含100 μM香豆素，延迟时间为0、10、20、100、300和800 ns。

从检测流程看，该体系仍保留一些需要改进的地方。检测后需要剪取试纸膜片、酸洗脱胶体金，再加入Ir-PIPB并完成发光测量，距离真正的一步式现场检测还有一定距离。硼酸基团也可能与含顺式二醇结构的多酚类物质发生反应，如果这些成分没有随层析过程被充分分离，就可能竞争性消耗探针并造成定量偏差。因此，实际应用需要配合同批次试纸、同步标准曲线和质控线内参校正。

论文对这一设计的另一层意义，是把“识别”和“读数”拆成了两个相互衔接但相对独立的环节。试纸条负责在流动过程中完成抗原抗体识别，洗脱后的溶液则交给Ir-PIPB进行发光分析。这样的安排为后续更换发光探针或调整读数设备留下了空间，也能避免把所有复杂材料都直接堆叠在试纸条上。当然，分步检测也意味着现场操作人员需要按照顺序完成多个动作，检测时间、膜片取样和洗脱体积的稳定性都会影响最终结果。因而，后续优化的重点不只是继续压低检出限，还包括把信号放大效果转化为更容易执行的操作流程。

总体而言，本研究把级联抗体放大、侧向层析和长寿命铱(III)发光探针组合起来，缓解了传统试纸检测中显色信号难以放大和定量的问题。该方法在氟虫腈和吡虫啉检测中获得了较低的检出限，并在草本样品中显示出与高效液相色谱相近的分析结果。下一步若能把膜片洗脱、探针加入和发光读取整合到试纸卡匣中，同时扩大真实样品和潜在干扰物验证范围，才更有利于判断这一体系在农产品现场筛查中的实际使用价值。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.snb.2026.139948