微流控超快速纳米等离激元比色法用于样本直接抗菌药物敏感性检测

1.引言

临床对抗菌药物耐药性的诊疗需求，会让医护人员尽快获取病原菌的具体种类以及最低抑菌浓度（MIC），但传统的肉汤微量稀释法、纸片扩散法以及各类自动化药敏检测系统，往往都需要过夜培养和纯菌分离的操作步骤，会让最终的检测结果延迟数十小时甚至数天的时间；基因型检测方法虽然具备更快的检测速度，但这类方法大多只能依托已知的耐药基因开展检测，没办法精准还原细菌真实的耐药表型，也很难直接测算出对应的MIC数值；从这一角度来看，能够直接从原始临床样本中完成病原菌鉴定和表型药敏检测的快速检测平台，会具备极高的临床应用价值。

QolorPhAST平台做到了微流控技术和纳米等离激元结构色检测技术的深度结合，一方面该平台的核心检测结构，是参照蜻蜓目昆虫复眼结构设计而出的周期半球形等离激元纳米图案（Pphen），这种特殊结构能够对周边介质折射率产生的微小波动，做出十分明显的颜色响应变化；另一方面该平台还会依托纳米等离激元增强LAMP技术完成病原菌分型鉴定工作，同时可以借助细菌代谢、生物活性变化引发的颜色波动，完成多浓度抗生素环境下的表型AST药敏检测，最后通过PhenoBot自动成像系统和机器学习算法，来智能解读所有检测数据与结果。

2.结果与讨论

第一点，QolorPhAST的整体架构设计与36分钟双通路检测体系；QolorPhAST平台主要由自动化PhenoBot成像系统和多通道微流控卡盒两大核心部分构成，能在同一套设备上并行完成病原菌鉴定工作和药敏表型分析工作；针对病原菌分型鉴定的环节，该平台可以依靠纳米等离激元增强LAMP技术，生成和细菌种属一一对应的专属颜色矩阵图谱；针对药敏检测的AST环节，存活细菌的代谢反应会将检测体系中的NAD+还原为NADH，进而带动活性染料产生氧化还原的动态变化，这一过程会直接改变检测液的整体折射率，而Pphen纳米结构可以把这些细微的折射率变化，放大成能够快速读取的RGB结构色信号；整套从样本上样到出具检测结果的完整流程，仅仅需要36分钟的时间，彻底规避了传统AST检测必须开展的过夜纯培养繁琐步骤。

图 1 QolorPhAST系统总体设计：传统AST与快速流程对比、细菌代谢引起的折射率变化、纳米等离激元结构色读出、LAMP鉴定及直接尿液药敏分析。

第二点，仿生Pphen纳米结构色的快速信号放大机制；Pphen结构可以依靠自身的周期半球纳米结构，生成对介质折射率高度敏感的专属结构色，细菌代谢过程会让resazurin、XTT、WST等常规活性指示体系产生部分还原反应，就能改变周边介质的折射率数值，进而引发表面等离激元共振的动态变化；传统检测染料往往需要完成充分的化学反应，才能呈现出肉眼可辨的明显颜色变化，而该平台的结构色只需要完成约20%的反应进程，就可以生成辨识度极高的视觉变化，能把整体的颜色响应速度提升大概8倍左右；EIS电化学检测、光谱检测以及LC-MS质谱检测等多项实验结果，都可以进一步佐证Pphen结构能够有效降低界面电荷的转移阻力，大幅加快细菌代谢信号的读出效率。

图 2 QolorPhAST纳米等离激元结构色检测机制，包括仿生Pphen结构、折射率响应、电子转移增强及代谢染料的快速颜色转换。

第三点，细菌生物活性与结构色信号的快速定量检测能力；研究团队专门对比了活菌与死菌分别引发的介质折射率变化情况，最终证实了结构色信号可以精准反映细菌细胞的真实代谢状态；在纳米限域的微流控特殊环境中，Pphen结构对低水平的细菌代谢波动，都具备极高的响应灵敏度，能够在30分钟左右的时间里，生成差异显著的颜色区分效果，可快速完成革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的活性判定工作；对比常规的荧光检测法和吸光度检测法，这套结构色检测体系可以在细菌代谢反应的早期阶段，就生成可精准量化的有效信号，能够为后续快速判定MIC数值筑牢数据基础。

图 3 QolorPhAST对细菌代谢与活性的结构色响应、灵敏度及与传统荧光/吸光度读出的比较。

第四点，纳米等离激元增强LAMP技术实现多菌种分型鉴定；该平台可以把LAMP基因扩增技术，集成到纳升级的微流控反应区域内部，能够依托Pphen结构放大后的颜色变化，快速识别出目标病原菌；研究团队针对大肠杆菌、肠球菌等常见致病菌，设计出了专属的特异性扩增引物，还将这套检测方法的适用范围，拓展到了10种泌尿系统常见的致病菌；不同种类的病原菌，都可以生成具备明显区分度的专属颜色矩阵，检测结果能够和凝胶电泳、qPCR、MALDI-TOF等主流参考检测方法的结果互相印证；研究团队还在34株和临床诊疗密切相关的革兰氏阴性菌、阳性菌菌株中，完成了分型检测测试，最终生成了清晰完整的IDtyping分型热图，充分证明了该平台具备多菌种并行识别的优异能力。

图 4 QolorPhAST纳米等离激元增强LAMP的病原菌IDtyping，包括扩增原理、引物特异性、参考方法验证及多菌株颜色矩阵。

第五点，多通道微流控表型AST检测与MIC智能判定；QolorPhAST配套的微流控卡盒，会提前预装专用培养基、活性检测染料以及不同浓度梯度的抗生素药物，设备可以依靠止流阀、过滤模块和可调吸力结构，自动完成样本的加载、混匀、富集、37℃恒温孵育以及并行成像检测等全部流程；平台能够把不同药物浓度梯度下采集到的颜色信号，精准转化为对应的MIC数值，同时支持人工阈值判读、SVM机器学习智能判读两种结果解读模式；研究团队针对革兰氏阴性菌、阳性菌的多种临床菌株，搭配15种抗生素药物开展了全面测试，QolorPhAST平台测算出的MIC数值，整体和标准肉汤微量稀释法的检测结果高度贴合，充分验证了这套快速表型药敏检测方案的可行性与准确性。

图 5 QolorPhAST微流控卡盒的药物预装、样本驱动和结构色成像流程，以及与标准BMD法比较的多菌种、多抗生素MIC结果。

第六点，疑似尿路感染患者样本的盲法临床验证；该研究开展了前瞻性的概念验证实验，选取54例疑似尿路感染患者的临床样本进行盲法检测，直接以原始尿液样本为检测对象，完成了细菌种属分型鉴定和两种临床常用抗生素的表型MIC检测工作；最终的检测数据可以证明，QolorPhAST平台的细菌种属鉴定结果，和临床标准参考结果有着极高的一致性；和传统BMD检测方法对比后，平台检测结果的平均分类一致率（CA）达到了91.81%，平均基本一致率（EA）达到了86.4%；最为关键的是，该平台对原始尿液样本的全套检测流程，从上样到出具药敏结果只需要36分钟，而传统的细菌培养联合BMD检测流程，往往需要经历两次过夜培养的步骤，时间效率的优势十分突出。

图 6 QolorPhAST在疑似尿路感染患者尿液中的盲法临床验证，包括病原菌分布、MIC比较、CA/EA评价和36 min检测时间优势。

3.总结

QolorPhAST平台成功把仿生纳米等离激元结构色技术、微流控并行处理技术、LAMP种属鉴定技术、表型细菌活性检测技术以及机器学习智能读出技术，整合集成到了同一套自动化检测系统当中，能够直接对临床原始样本完成病原菌分型鉴定和药敏检测工作；该平台的核心应用价值，不只是提升了单一检测环节的灵敏度，更是大幅压缩了“样本采集-病原菌鉴定-MIC结果出具”的整体周转时长；54例疑似尿路感染临床样本的验证实验，充分证明了该平台具备走向临床即时诊断的巨大潜力；不过针对部分需要特殊离子环境、特殊培养条件的抗生素药物，以及混合细菌感染的复杂样本场景，平台配套的微流控卡盒和智能判读算法，还有进一步优化升级的空间。

论文链接：https://doi.org/10.1038/s41565-025-02075-z