壳聚糖功能化金纳米簇双模式生物传感器用于人血浆肝素定量检测

肝素是临床广泛使用的抗凝药物，用药不足会发生血栓，过量则会引发出血、血小板减少等严重不良反应，因此需要对体内肝素浓度开展监测。目前临床主流aPTT、抗Xa因子检测属于间接活性检测，操作繁琐，易受纤溶、血小板异常等因素干扰，难以直接定量肝素总含量。纳米材料生物传感器为肝素快速床旁检测提供新思路，但多数现有传感器仅依靠单一信号输出，抗干扰能力有限。因此亟需开发兼具荧光、比色双读值，可在复杂生物基质中实现肝素高特异性定量的传感体系。

本试验借助微波辅助法制备壳聚糖功能化自组装金纳米簇Ch‑AuNCs，利用Zeta电位、XPS、FTIR、ITC、TEM等手段解析肝素与Ch‑AuNCs相互作用的分子机理，阐明肝素破坏自组装AIE结构引发荧光猝灭、同时桥接纳米簇提升类过氧化物酶活性的双重传感机制；建立荧光、比色两套检测体系，评价传感器检测线性范围、检出限与抗干扰性能，在胎牛血清、人血浆、人血清中完成方法学验证，与临床aPTT金标准进行相关性比对；制备纸基传感圆盘，结合手机成像分析实现肝素便携检测，为肝素临床治疗监测提供低成本、可现场使用的双模式检测工具。

研究内容

壳谷三官能基化金纳米簇的合成与表征：采用微波辅助法合成壳聚糖功能化金纳米簇Ch‑AuNCs。通过TEM、XPS、FTIR、TGA等多种手段完成材料表征，该纳米簇具备自组装聚集诱导发光效应与类过氧化物酶活性，量子产率显著提升，批次重现性良好，为肝素传感提供性能优异的基底材料。

图1。a）壳聚糖、谷胱甘肽和肝素二糖单位的化学结构。b）微波辅助合成Ch-AuNCs的示意图。c）根据吸收数据推导出的Tauc图，用于估算光学带隙。d）在不同激发波长下记录的荧光强度，以确定最大激发波长。

图2。不同倍率下的Ch-AuNC透射电子元件图像：a）100纳米，c）50纳米，e）（c）内嵌，显示高倍率视图（10纳米比例条）及选定区域的平面间距。b）颗粒尺寸分布的直方图，表示平均自组装复合材料直径，d）纳米簇的平均芯径。f）EDX分析确认元素成分。g）高分辨率HAADFSTEM图像，以及（h–l）元素映射，均由Ch-AuNCs生成。

图3。a）XRD图谱，b）Ch-AuNCs、几胞聚糖和谷胱甘肽的TGA热图。高分辨率解卷积的XPS光谱显示c）GSH的S2p窄扫描，d）S2p窄扫描，e）Ch-AuNCs的Au4f窄扫描。f）Ch-AuNCs、GSH和几胞菌的FTIR谱。g）对稳定自组装的Ch-AuNC形成的相互作用进行示意图示。

Ch-AuNCs对肝素的荧光感应反应：随肝素浓度升高Ch‑AuNCs发生荧光猝灭，荧光模式线性检测区间0.25‑15 U/mL，检出限0.016 U/mL。该体系对肝素及低分子肝素响应显著，对糖胺聚糖等类似物质响应微弱，在血清基质中依旧可以实现肝素的荧光定量检测。

图4。a）Ch-AuNCs在紫外光下的摄影图像，展示了肝素（HP-B）浓度增加时荧光熄灭的过程。b）添加肝素后，Ch-AuNCs的光致发光发射光谱范围为0.25至45U/mL。c）显示F/F比值的校准图0在测试浓度范围内，605nm与肝素相比，在高浓度下表现出非线性（饱和）响应。这里，F和F0分别表示肝素存在和缺失时的PL强度。误差条代表三种独立测量的标准差。阴影绿色区域代表临床相关UFH剂量范围，通常在心血管手术中为2–8U/mL，术后护理为0.2–1.2U/mL;而阴影红色区域则对应可能表明剂量过高的浓度，伴随并发症风险增加。d）荧光响应的线性拟合，表示为（F0/F）−1，在用于定量的线性响应范围（0.25至15U/mL）内;每个点是三项测量的平均值。e）GAGs间的选择性：Ch-AuNCs对来自牛和猪来源肝素、LMWH及结构相似GAGs的荧光反应。插图：添加GAGs后Ch-AuNCs的摄影图像，显示对肝素（HP-P和HP-B）和LMWH的选择性荧光淬灭。f）特异性研究：在肝素及常见生物/生理干扰因子存在下，Ch-AuNCs的选择性荧光反应，确认检测特异性。

Ch-AuNCs对肝素的比色感应反应：肝素能够增强Ch‑AuNCs类过氧化物酶活性，催化TMB显色，比色模式线性范围0‑30 U/mL，检出限0.023 U/mL。动力学测试表明肝素可提升底物亲和力与最大反应速率，对肝素类物质具备良好选择性，可用于复杂样本比色定量。

图5。a）显示可见色彩显影的摄影图像，与肝素（HP-B）浓度相关。b）紫外-可见光谱显示在肝素浓度（0.25至45U/mL）增加下，Ch-AuNCs的过氧化物酶样活性增强。c）610nm吸光率与肝素在测试浓度范围内的校准曲线，显示高浓度下具有非线性（饱和）响应。误差条代表三种独立测量的标准差。阴影绿色区域代表临床相关UFH剂量范围，通常在心血管手术中为2–8U/mL，术后护理为0.2–1.2U/mL;而阴影红色区域则对应可能表明剂量过高的浓度，伴随并发症风险增加。d）吸收率与肝素浓度在0至30U/mL范围内的线性响应;每个点是三项测量的平均值。e）GAGs间的选择性：Ch-AuNCs对来自牛和猪源的肝素、LMWH及结构相似GAGs的比色反应。插图：照片显示Ch-AuNCs在肝素和LMWH方面较其他GAGs选择性增强。f）特异性研究：在肝素及常见生物/生理干扰剂存在下，Ch-AuNCs的选择性比色增强反应，确认检测特异性。

图6。在肝素缺失（a–d）和存在（e–h）的情况下，Ch-AuNCs的稳态动力学分析。Michaelis-Menten绘制了初始速度与底物浓度（a，b）的关系图（a，b），（e，f）含肝素，这些图通过调整一种底物浓度而保持另一底物浓度恒定得到。Michaelis-Menten方程（c，d）双倒易的Lineweaver-Burk图（不含肝素）和（g，h）含肝素的图，其中V图马克斯以及Km数值被计算出来。误差条代表三种独立测量的标准差。

阐明Ch-AuNCs与肝素分子相互作用的特异性：借助Zeta电位、XPS、FTIR以及ITC等温滴定量热开展分子层面分析，证实依靠静电作用实现二者结合；肝素高硫酸化特征带来强相互作用，而硫酸化程度低的糖胺聚糖结合作用弱，解释了传感器对肝素的高选择识别能力。

图7。高分辨率去卷积XPS光谱显示a）N1，b）S2p，c）O1。d）FTIR谱，显示肝素、Ch-AuNCs及其复合物（CH-AuNC-肝素）。Ch-AuNCs-肝素复合物的ITC结合等温线，显示e）时间间功率差异的原始热成像，f）带有相应结合参数的集成热图。透射电子显微镜图像（比例条：100nm;为清晰起见）g）来自图2a的Ch-AuNC显微图，正带电的纳米簇被环绕，h）Ch-AuNCs和肝素复合物显示AIE结构破坏，多个纳米簇桥接形成负电界面，i）肝素-纳米簇组合稀释，确认自组装Ch-AuNCs被拆解为核心纳米簇。

Ch-AuNCs在具有临床意义的生物基质中肝素检测中的表现：在胎牛血清、人血浆、人血清中开展加标回收实验，回收率处于93‑112%；检测结果与临床标准aPTT试验具备高度相关性；进一步开发纸基‑智能手机便携平台，可完成临床浓度范围内肝素的定量检测。

图8。aPTT测定法与提出的方法相关性：a）荧光反应呈负相关，b）比色反应呈正相关。

基于纸质肝素检测平台的开发：将Ch‑AuNCs修饰在滤纸片上制备纸基传感圆盘，结合智能手机拍照与图像软件完成信号读取；可分别实现荧光猝灭与比色显色两种信号输出，纸基平台检出限略高于液相体系，可覆盖临床肝素浓度区间；在血清样本中回收率良好，无需大型仪器，适用于肝素床旁快速筛查检测。

图9。a）基于滤纸的便携式传感器盘制造工艺示意图，用于比色/荧光检测临床相关肝素。图像使用智能手机拍摄，并使用ImageJ软件和移动应用进行分析。Ch-AuNCs浸渍滤纸的照片显示，b）紫外线下光致发光淬灭，c）在环境光下肝素浓度增加（0.25至45U/mL）下可见色彩增强。d）荧光响应（F/F0以及e）比色响应，利用ImageJ软件和基于智能手机的应用程序，在测试浓度范围内显示高浓度时呈非线性反应。对应的线性响应为e）荧光和g）比色脱离，分别在0.25至20U/mL和0.25–25U/mL范围内观察到。这里，F和F0分别表示肝素存在和缺失时的PL强度。误差条代表三种独立测量的标准差。

Ch-AuNCs对肝素的双模反应机制性见解：肝素依靠静电作用破坏Ch‑AuNCs自组装AIE结构，引发荧光猝灭；同时肝素作为多阴离子桥接多个纳米簇，形成带负电界面，提升类过氧化物酶催化活性。两种互补机制共同实现荧光‑比色双模式信号输出。

图10。Ch-AuNCs在肝素添加后提出的双模传感机制示意图。a）由于自组装AIE基体被破坏导致荧光熄灭，肝素与Ch-AuNCs之间的静电相互作用会削弱自组装。b）纳米簇间桥接形成带负电的界面，增强TMB亲和力和过氧化物酶活性。

结论

本试验依托c‑TRAK‑TN多中心Ⅱ期临床队列，纳入159例中高危复发风险早期三阴性乳腺癌患者，收集随访血浆样本开展ctDNA监测；头对头对比无组织ctDNA、dPCR、多变异肿瘤知情ctDNA三种MRD检测方案，评估无组织ctDNA检测的复发预后价值，统计不同检测手段的样本符合率与复发预警前置时间；分析不同检测体系的优势与结果不一致样本产生的原因，探究无组织ctDNA在肿瘤原发组织缺失场景下的应用潜力；研究证实无组织ctDNA具备良好的复发预测效能，但仍存在假阳性、假阴性局限，为早期三阴性乳腺癌MRD监测的临床方案选择提供循证依据。

论文链接：10.1016/j.carbpol.2026.125660