绕开PAM和核酸扩增，一锅式CRISPR/Cas12a检测食品污染菌

食品中的细菌污染并不总是伴随明显的颜色、气味或质地变化，单凭感官判断容易漏掉处于早期或低水平的污染。培养法虽然仍是食品微生物检测的重要参考，但往往需要12–14小时甚至更长时间；PCR、RPA和LAMP等核酸扩增方法可以缩短检测周期，却增加了反应步骤、设备要求和气溶胶交叉污染风险。对于需要在生产、储运或现场环节快速判断的样品，检测方法既要有足够的灵敏度，也要尽量减少开盖、转移和中间处理。

CRISPR/Cas12a具有两种相关的切割能力。当引导RNA识别目标双链DNA后，Cas12a可以先切割目标序列，随后对体系中的单链DNA报告探针进行非特异性反式切割，产生可测量的荧光信号。现有CRISPR检测通常需要先进行PCR、RPA或LAMP扩增，以获得足够的目标量；同时，Cas12a识别双链DNA还受到PAM序列限制。扩增和PAM依赖共同影响了体系的操作简便性、靶点选择范围以及现场应用稳定性。

本研究的思路是利用细菌基因组中多个限制性内切酶识别位点来放大可用信号，而不是复制目标核酸。研究人员发现，两种目标细菌基因组中都存在数量较多的EcoRI识别位点。EcoRI切割后，一个基因组分子可以产生多个带有4个核苷酸突出端的DNA片段；这些黏性末端再与一条本身不能单独激活Cas12a的短单链DNA结合，组装成完整的激活结构。随后，Cas12a被激活并切割荧光报告探针，最终把一个目标基因组带来的信息转化成多个荧光触发机会，这就是论文所称的“一个变多个”效应。

图1. EcoRI介导的“一个变多个”、PAM非依赖和无扩增CRISPR/Cas12a检测系统原理。（A）细菌基因组DNA中限制性内切酶识别位点示意图；（B）嗜酸耐热菌和阪崎克罗诺杆菌基因组中常见限制性内切酶识别位点数量；（C）一锅式EcoRI-CRISPR/Cas12a系统的工作原理。

这一设计同时解决了两个问题。首先，检测信号来自限制性内切酶产生的多个黏性末端和Cas12a反式切割的连续作用，不需要另行进行核酸扩增。其次，Cas12a实际接收到的是由黏性末端和短单链DNA共同形成的激活结构，因此可以绕开对典型PAM位点的严格要求。由于EcoRI和Cas12a可以在相同温度条件下工作，两个环节被整合在同一支反应管中，减少了中间转移和开盖操作，也有助于降低扩增产物污染带来的假阳性风险。

图2. 一锅式EcoRI-CRISPR/Cas12a系统的可行性验证。（A）EcoRI切割目标基因组DNA产生黏性末端单链DNA突出端，并与单链DNA结合以激活一锅式EcoRI-CRISPR/Cas12a系统的示意图；（B）由EcoRI切割产物与单链DNA结合激活的一锅式EcoRI-CRISPR/Cas12a系统实时荧光图像；（C）由EcoRI水解产物与单链DNA组合激活的一锅式EcoRI-CRISPR/Cas12a系统终点荧光；（D）EcoRI介导的CRISPR/Cas12a系统一步反应和两步反应的比较；（E）一步反应和两步反应的实时荧光比较；（F）从5′端缩短与EcoRI水解产物结合的单链DNA长度对CRISPR/Cas12a活性的影响；（G）从3′端缩短与EcoRI水解产物结合的单链DNA长度对CRISPR/Cas12a活性的影响。

实验结果支持了上述反应逻辑。只有当目标DNA、EcoRI、Cas12a、引导RNA、短单链DNA和荧光报告探针等关键组分同时存在时，体系才出现明显荧光；缺少任一必要组分，信号都接近背景水平。一步式和两步式反应均可在60分钟内完成，且一步式反应不需要在两个阶段之间转移反应液。对短单链DNA长度的比较显示，15个核苷酸的ssDNA-2能够在信号强度和背景水平之间取得较好平衡。长度过长可能带来一定的非特异激活，过短或与黏性末端之间存在间隔时，Cas12a激活效率则明显下降。

在反应条件优化后，体系的最佳反应时间确定为60分钟。随着反应从10分钟延长到120分钟，荧光信号总体增加，但60分钟后逐渐进入平台期，继续延长带来的信号提升并不明显。研究还对引导RNA、EcoRI、Cas12a和两类报告单链DNA的用量进行了调整，以避免浓度过低导致信号不足，或因游离组分过多造成背景升高。最终形成的反应体系兼顾了信号输出和操作时间，为后续开展食品样品检测提供了基础。

图3. 一锅式EcoRI-CRISPR/Cas12a系统的检测性能。（A）一锅式EcoRI-CRISPR/Cas12a系统检测嗜酸耐热菌和阪崎克罗诺杆菌的操作流程；（B）和（C）利用一锅式EcoRI-CRISPR/Cas12a系统检测嗜酸耐热菌和阪崎克罗诺杆菌的特异性；（D）和（E）利用一锅式EcoRI-CRISPR/Cas12a系统检测嗜酸耐热菌的实时荧光和终点荧光；（F）一锅式EcoRI-CRISPR/Cas12a系统检测不同浓度嗜酸耐热菌对应的525 nm荧光强度，插图为荧光强度与浓度之间的线性关系；（G）和（H）利用一锅式EcoRI-CRISPR/Cas12a系统检测阪崎克罗诺杆菌的实时荧光和终点荧光；（I）一锅式EcoRI-CRISPR/Cas12a系统检测不同浓度阪崎克罗诺杆菌对应的荧光强度，插图为荧光强度与浓度之间的线性关系。

在特异性实验中，体系对目标细菌表现出明显的选择性。以嗜酸耐热菌为例，目标浓度从5.68×10¹增加到5.68×10⁷ CFU/mL时，实时和终点荧光均随浓度升高而增强，标准曲线的R²为0.98661，检出限为13.38 CFU/mL。阪崎克罗诺杆菌的标准曲线R²为0.98162，检出限为18.67 CFU/mL。两种细菌的检测结果说明，基因组中限制性位点的数量、磁性富集效果以及Cas12a报告反应共同影响最终灵敏度。

与常规qPCR和扩增耦合的CRISPR检测相比，这一方法的主要特点是省去了目标核酸扩增，且在低浓度范围内保持了可比的检测性能。作者还指出，EcoRI切割和Cas12a反式切割构成了连续的双重信号放大；EcoRI对特定序列的识别、Cas12a与引导RNA的配对以及短单链DNA的组装，则共同提供了多层次的特异性。将反应物预先放在同一管内，也减少了中间分离和转移步骤。

图4. 一锅式EcoRI-CRISPR/Cas12a系统的实际样品应用。（A）一锅式EcoRI-CRISPR/Cas12a系统与平板计数法的流程比较；（B）一锅式EcoRI-CRISPR/Cas12a系统在果汁和牛奶样品中的检测表现；（C）分别利用一锅式EcoRI-CRISPR/Cas12a系统和平板计数法检测嗜酸耐热菌和阪崎克罗诺杆菌所得结果的热图。

研究团队进一步在苹果汁和牛奶中测试了该体系。经过样品处理和目标细菌富集后，嗜酸耐热菌污染的苹果汁以及阪崎克罗诺杆菌污染的牛奶均产生了区别于阴性样品的明显荧光信号。检测结果与平板计数法进行了对照，显示该方法能够在较短时间内完成食品污染菌的筛查。需要说明的是，这一验证仍然依赖目标细菌的富集、基因组DNA提取和荧光读取，当前结果证明的是对加标或实验设置样品的检测可行性，并不等同于已经完成复杂市场样品中的全面现场验证。

总体而言，本研究通过限制性内切酶产生的多黏性末端，把一个基因组分子转化为多个Cas12a激活机会，在不进行核酸扩增的情况下提高了检测信号；通过一锅式设计，又减少了反应过程中的转移和开盖操作。该平台已经在嗜酸耐热菌和阪崎克罗诺杆菌检测中显示出较好的灵敏度和特异性。后续若能进一步压缩样品前处理时间，建立更稳定的便携式荧光读数方式，并在天然污染和更多食品基质中验证，才能更准确地评估其在食品安全现场监测中的应用价值。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.bios.2026.118815