双信号自校准电化学传感器提升花生过敏原Ara h 1检测可靠性

花生营养丰富、风味突出，常被加入多种食品中，但也因此增加了过敏原交叉接触的机会。Ara h 1是花生中的主要过敏原之一，微量残留也可能给过敏人群带来风险。现有的质谱、酶联免疫吸附测定和PCR等方法能够用于过敏原分析，但通常需要专门仪器、较复杂的前处理或经过培训的操作人员。电化学传感器具有响应快、设备相对简单等特点，不过单信号检测容易受到电极状态、环境变化和背景噪声影响，重复性和结果可靠性仍有提升空间。

比率型电化学检测的思路，是同时记录一个随目标增加而变化的检测信号和一个用于参照的内标信号，再利用两者的比值进行定量。这样可以部分抵消电极制备、样品基质和测量条件波动造成的影响。本研究选择具有导电性和多孔结构的氢键有机框架（HOF）作为信号放大材料，并以镍卟啉配体构建Ni-HOF。HOF由有机连接体通过氢键等分子间作用力自组装形成，具有可设计的孔结构、较大的比表面积和较好的水相稳定性。

方案1. 基于Ni-HOF@Thi、SiO2@Fc@Au和Ara h 1抗体与适配体双重识别的比率型电化学免疫传感器构建示意图。NH2-SiO2与Fc-COOH反应形成SiO2@Fc时，使用EDC和NHS活化Fc的羧基，促进其与SiO2氨基之间形成酰胺键。

传感器包含两个分工不同的部分。第一部分是沉积在玻碳电极上的SiO2@Fc@Au复合材料。二茂铁羧酸（Fc-COOH）被共价固定在二氧化硅纳米颗粒上，提供较稳定的二茂铁电化学信号；金纳米颗粒则用于改善二氧化硅导电性，并为Ara h 1适配体提供结合位点。第二部分是Ni-HOF@Thi@Ab。带负电的Ni-HOF可以吸附带正电的硫堇（Thi），同时负载Ara h 1抗体，形成检测探针。适配体和抗体分别从电极两侧识别Ara h 1，最终形成夹心结构。

在没有目标蛋白时，电极主要表现出Fc的参照信号；当Ara h 1存在时，适配体先在SiO2@Fc@Au界面结合目标，随后Ni-HOF@Thi@Ab通过抗体完成第二次识别。夹心结构形成后，探针被带到电极表面，Thi信号增强，而生物分子层和空间阻碍使Fc信号减弱。因此，Ara h 1浓度升高会带来IThi/IFc比值上升。两个氧化还原峰的电位相距较远，便于在同一次差分脉冲伏安测量中分别读取。

图1. Ni-HOF的表征。（A）Ni-HOF的PXRD数据，包括实验PXRD图谱、Pawley精修结构和差值；（B）Ni-HOF浸水7天前后的PXRD数据；（C）Ni-HOF的N2吸附–脱附等温线，插图为利用密度泛函理论计算的孔径分布；（D）合成Ni-HOF的XPS全谱；（E）C 1s区域；（F）N 1s区域；（G）O 1s区域；（H）Ni 2p区域；（I）Ni-HOF的SEM图像；（J）Ni-HOF的TEM图像；（K）Ni-HOF@Thi的SEM图像；（L）Ni-HOF@Thi对应的EDS图像。

材料表征支持了Ni-HOF和复合探针的成功制备。Ni-HOF由TCPP-Ni在DMF与TCB混合溶剂中经100℃溶剂热反应48小时得到，产率为76%。PXRD实验结果与结构模拟和Pawley精修结果相符；在水中浸泡7天后，Ni-HOF仍保持晶体结构。其BET比表面积为380.5 m²/g，平均孔径约1.5 nm。扫描电镜和透射电镜显示，Ni-HOF呈棒状、片层相互重叠的形貌。Ni-HOF@Thi中出现硫元素，也说明硫堇已经被成功负载。

另一端的SiO2@Fc@Au复合材料也经过了逐步确认。红外光谱显示，Fc与氨基化二氧化硅之间形成了酰胺键；电镜图像显示，Fc修饰没有明显改变二氧化硅的球形形貌，金纳米颗粒则成功分布在其表面。电化学阻抗和循环伏安结果表明，加入金纳米颗粒后，SiO2@Fc电极的电子传递得到改善。在100 mV/s扫描速率下，SiO2@Fc@Au/GCE的峰电流约为SiO2@Fc/GCE的3.8倍，峰间电位差也由172.2 mV降低至138.8 mV。

图2. Ara h 1比率型电化学传感器的可行性验证。（A）Ara h 1夹心ELISA；（B）SiO2@Fc/GCE在不同扫描速率下的循环伏安曲线；（C）SiO2@Fc/GCE的氧化还原峰电流与扫描速率之间的关系；（D）SiO2@Fc/GCE峰电位与ln v之间的关系；（E）SiO2@Fc@Au/GCE在不同扫描速率下的循环伏安曲线；（F）SiO2@Fc@Au/GCE的峰电流与扫描速率之间的关系；（G）SiO2@Fc@Au/GCE峰电位与ln v之间的关系；（H）Ni-HOF在硫酸钠溶液中的Mott–Schottky曲线；（I）电极构建过程的Zeta电位；（J）不同电极的循环伏安曲线；（K）不同电极的电化学阻抗谱；（L）不同电极的差分脉冲伏安曲线。

可行性实验显示，Ara h 1适配体和抗体能够共同形成特异性夹心结构。随后，研究人员对电极逐层修饰过程进行了电化学分析。适配体、BSA和Ara h 1依次固定后，Fc电流逐渐减弱，反映出生物分子层对电子传递的阻碍；加入Ni-HOF@Thi@Ab后，约−0.164 V处出现新的Thi峰，同时Ni-HOF的导电性使整体电化学响应发生变化。连续20次循环伏安扫描后，Fc和Thi峰电流基本保持不变，说明两个信号均具有较好的稳定性。

在优化条件下，随着Ara h 1浓度从5 ng/mL增加到1250 ng/mL，Fc信号逐渐降低，Thi信号逐渐升高。IThi/IFc与Ara h 1浓度对数之间呈线性关系，拟合方程为IThi/IFc=0.81 log C Ara h 1−0.41，R²为0.995，检测限为1.29 ng/mL。与单信号传感器相比，比率信号的稳定性更好：在10 ng/mL Ara h 1条件下，10个独立传感器的比率信号RSD为1.27%，而单信号响应的RSD为10.37%。

图3. Ara h 1比率型电化学传感器的检测性能。（A）不同Ara h 1水平下传感器的差分脉冲伏安曲线；（B）IThi或IFc与Ara h 1浓度对数之间的线性关系；（C）IThi/IFc与Ara h 1浓度对数之间的校准曲线；（D）不同批次比率型传感器的电化学响应；（E）不同批次单信号传感器的电化学响应；（F）不同干扰蛋白存在时Ara h 1传感器的特异性；（G）和（H）比率型电化学传感器的稳定性；（I）比率型电化学传感器的重复性。图F–I中Ara h 1和干扰物浓度均为250 ng/mL。

选择性实验中，豆粕7S球蛋白、花生过敏原Ara h 2、β-乳球蛋白、卵清蛋白和麦醇溶蛋白产生的比率信号都接近背景水平；当这些干扰蛋白与Ara h 1同时存在时，测得结果与单独加入Ara h 1的结果基本相近，说明双重识别结构对目标具有较好的选择性。电极在4℃保存2–10天后，Thi、Fc及其比率信号仍保持在初始值的95%以上。不同批次Ni-HOF制备的传感器，其比率信号RSD为1.93%，显示出较好的批间重复性。

研究人员还对20份食品样品进行了初步筛查，检测到15%的样品出现Ara h 1信号。随后，在3份阳性样品和1份阴性样品中开展加标回收实验，回收率为97.71%–103.10%，RSD为1.19%–4.06%。在低浓度加标时，测得结果与样品原有含量和加标量之和较为接近；高浓度加标时，阳性样品中的原有Ara h 1含量可能受到测量误差影响。与商业ELISA试剂盒比较，两种平台的结果没有显著差异（p>0.05）。

总体来看，本研究利用Fc参照信号和Thi检测信号构成自校准比率体系，降低了单一电化学信号对测量条件的依赖；Ni-HOF的多孔和导电特性，则为信号分子和抗体的负载提供了材料基础。该传感器在Ara h 1检测中兼顾了灵敏度、特异性和重复性，并在实际食品样品中显示出应用潜力。需要注意的是，现有结果主要来自有限数量的食品样品和加标验证，后续仍需在更多天然污染样品、不同食品基质及更大样本量中进一步评估。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.bios.2026.118866