利用表面增强拉曼光谱法定量检测食品基质中的沙门氏菌和李斯特菌

1.引言

食源性疾病是全球范围很严重的卫生问题，美国每年就报告约4800万例病例，因此需要快速、可靠的致病菌检测手段。传统培养法耗时较长，通常至少需48小时才能得出结果；MALDI-TOF质谱等技术也很难直接用在复杂食品样本。表面增强拉曼光谱（SERS）有灵敏度高和可提供独特的分子振动指纹的优点，被当作细菌检测的有力工具；结合聚合物亲和剂（如pHEMA）将细菌富集至等离子体"热点"区域，可以增强信号并实现区分，这些为研发食源性致病菌快速传感方法奠定了基础。

本研究开发了一种基于聚合物亲和剂pHEMA₁₀₅修饰金膜纳米球（FON）基底的表面增强拉曼光谱（SERS）传感技术，通过将沙门氏菌和李斯特菌与pHEMA₁₀₅预复合后滴加至FON基底进行SERS测量，结合光谱主成分分析（PCA）、十倍稀释苹果汁基质中的定量校准曲线构建、纯苹果汁中2℃/22℃/37℃变温检测及超声处理实验，实现了两种致病菌的有效区分与定量检测，观测检出限达158 CFU/mL，解决了传统培养法耗时久、难以直接检测复杂食品基质中细菌的问题，为食源性致病菌快速筛查提供了免标记、稳健通用的全细胞分析方法，对食品安全监测具有重要意义。

2.结果与讨论

整体分析流程：先将pHEMA₁₀₅聚合物亲和剂与沙门氏菌或李斯特菌悬液进行1小时预复合，再将混合物滴加至金膜纳米球（FON）基底上室温孵育2小时后进行SERS测量（785 nm激发、38 mW功率、15 s积分时间，每个条件测5片FON、每片10个随机位点共50个光谱），构建了"预复合—沉积—检测"的免标记传感流程。

图 1 整体分析工作流程的示意表示。简而言之，pHEMA₁₀₅聚合物亲和剂首先与细菌悬浮液（S. typhimurium或L. monocytogenes）在前复合物步骤中混合。所得混合物随后沉积到FON基底上，并在室温下孵育，随后进行SERS测量。

两种致病菌的SERS光谱指纹表征：对比不加亲和剂与经pHEMA₁₀₅预复合后的SERS光谱发现，无亲和剂时两菌光谱几乎无法区分，说明细菌对FON表面天然亲和力弱；复合后出现丰富特征谱带（665、735、890、965、981、999、1031、1089、1316、1450、1584 cm⁻¹，分别归属鸟嘌呤、腺嘌呤、蛋白、嘌呤代谢物、脂质、肽聚糖、多糖及核酸等），其中沙门氏菌的981、1316 cm⁻¹带增强（对应革兰氏阴性菌富脂外膜），李斯特菌的1450 cm⁻¹带增强（对应革兰氏阳性菌厚肽聚糖层），实现了对两菌光谱指纹的表征与初步区分。

图 2 S. typhimurium和L. monocytogenes的SERS光谱及光谱指纹。（A）无pHEMA₁₀₅的S. typhimurium（红色）和L. monocytogenes（蓝色）的SERS光谱。（B）与pHEMA₁₀₅复合物的S. typhimurium（绿色）和单核细胞增生L. monocytogenes（紫色）的光谱，与单独pHEMA₁₀₅（黑色）相比。每个显示的光谱是总共50次测量的平均值，每个FON测量10次，每个条件对应5个FON

pHEMA₁₀₅对区分能力的关键作用（PCA分析）：对"细菌直接沉积"和"与pHEMA₁₀₅预复合"两组光谱数据分别做主成分分析，结果显示无聚合物时两菌数据点在PCA图中严重重叠、无法可靠区分，复合后两簇明显分离；定量比较进一步证实复合使735、965、1316、1584 cm⁻¹等细菌特征带强度平均提升102%（约2.0倍，沙门氏菌）和42%（约1.4倍，李斯特菌），FON批间重复性的相对标准差也由25%、46%分别降至15%、24%，证明pHEMA₁₀₅兼具信号增强与区分赋能的双重作用。

图 3 pHEMA₁₀₅ 导致的歧视。（A）PCA图对应图2 A中对应的SERS光谱，仅含细菌（无与pHEMA₁₀₅的复合物），显示两个细菌属之间没有数据分离。（B）PCA图对应图2B中的SERS谱，其中细菌分析物与pHEMA₁₀₅复合，显示出对属数据点的辨别能力。

主成分载荷分析（区分驱动谱带识别）：通过PC载荷向量对拉曼位移作图识别出驱动两菌分离的关键谱带：735 cm^-1（腺嘌呤，反映嘌呤代谢活性差异）、665与965 cm^-1（嘌呤代谢物含量差异）、981 cm^-¹（脂质，革兰氏阴性菌外膜特征）和1450 cm^-1（肽聚糖，革兰氏阳性菌细胞壁特征），胞外生物标志物与细胞壁结构成分的联合贡献表明pHEMA₁₀₅是一种多功能亲和剂，通过非共价氢键等相互作用捕获多样化生化指纹，从而区分化学性质迥异的细菌物种。

图 4 PC负载与拉曼位移图分别绘制了（A）仅对应细菌（不含pHEMA₁₀₅）的SERS光谱，以及（B）与pHEMA₁₀₅配合时对应细菌分析物的SERS光谱。

10倍稀释苹果汁中的定量检测光谱：以10倍稀释苹果汁为模型复杂食品基质，将不同浓度的两菌与恒定1 mM pHEMA₁₀₅复合后在FON基底上测量（每条件50个光谱平均），结果显示与细胞壁成分相关的特征振动带强度随细菌浓度升高呈系统性变化（图中蓝框标注谱带），为后续构建定量校准曲线提供了光谱依据。

图 5 （A）与pHEMA₁₀₅复合物的S. typhimurium浓度范围，以及（B）单核细胞增生链球菌与pHEMA₁₀₅复合物的一系列浓度。蓝色方框突出显示图6中用于构建响应曲线的谱特征。

定量校准曲线与检出限：以515 cm⁻¹处pHEMA三硫代碳酸酯端基峰为内标进行归一化，沙门氏菌的I981/I515比值与李斯特菌的I1450/I515比值均与菌浓度呈对数线性关系（R²分别为0.9175和0.8998），外推检出限分别为4和2 CFU/mL，观测检出限均为158 CFU/mL；单因素方差分析与Tukey事后检验表明低浓度信号显著低于高浓度信号、最高浓度出现热点占位饱和，两菌相近的灵敏度证明单一聚合物亲和剂可有效作用于革兰氏阳性和阴性两类细菌。

图 6 （A）伤血梭菌和（B）单核细胞增生链球菌的SERS反应曲线。横线虚线表示观测到的LOD。误差条表示均值的标准误，星号（*）表示统计学显著差异（p < 0.05）。

未稀释纯苹果汁中的变温检测：将两菌分别于2℃（冷藏）、22℃（运输室温）和37℃（最适生长温度）的未稀释苹果汁中过夜培养后进行SERS测量，结果显示复杂基质下三个温度时细菌与pHEMA105的主要特征带均清晰可见，定量谱带（981、1450 cm⁻¹）保持稳定，仅735 cm⁻¹等嘌呤代谢相关带随温度出现细微变化；PCA显示两菌在纯果汁中仍可实现分离，且22℃时区分效果最佳，验证了该平台在真实食品基质与不同储运温度下的稳健性。

图 7 在不同温度下，未稀释AJ生长后细菌分析物的检测。（A）在AJ中不同温度下生长的S. typhimurium光谱。（B）在AJ中不同温度下生长的单核细胞增生链锥菌的SERS光谱。（C）在AJ中不同温度下，S. typhimurium与L. monocytogenes的PCA图对应;每个案例中展示的PC是两种细菌间分离最明显的。

超声处理后的SERS检测：对两菌进行2小时水浴超声破碎后再与pHEMA105复合测量，超声诱导产生菌种特异性光谱变化——沙门氏菌在890、965、999、1031、1089 cm⁻¹（蛋白、嘌呤代谢物、多糖、碳水化合物/脂质/核酸相关）处强度增加，李斯特菌则在735、965、1584 cm⁻¹（嘌呤代谢物）处增强，PCA实现两菌清晰区分；该结果证实了革兰氏阴性菌结构更脆弱、阳性菌厚肽聚糖层更耐机械破坏的细胞壁本质差异，表明超声可作为增强区分的辅助手段，并有望实现"灭活与检测一步化"。

图 8 超声波后细菌分析物的SERS检测。（A）两种与pHEMA105复合的细菌的SERS光谱，可进行或不进行超声波处理。（B） 图8 A中S. typhimurium和L. monocytogenes超声2小时后的数据PCA图。图中的每个数据点代表一个捕获的频谱。

3.总结

本研究具有多方面显著优势：一是免标记、快速，无需传统培养法耗时漫长的分离步骤，仅通过pHEMA105与细菌的简单预复合即可完成细菌捕获与信号富集，大幅缩短检测周期；二是通用性强，单一聚合物亲和剂即可同时作用于革兰氏阴性沙门氏菌与革兰氏阳性李斯特菌，实现两类致病菌的有效区分与定量检测，观测检出限达158 CFU/mL；三是稳健性优异，即使在未稀释苹果汁等复杂食品基质及2℃、22℃、37℃不同储运温度下仍保持稳定检测性能；此外，该平台还可结合超声处理，具备"灭活与检测一步化"的应用潜力，为食源性致病菌快速筛查提供了一种通用、可靠的分析新方法。

论文链接：https://doi.org/10.1021/acssensors.6c02222