把“活菌风险”从总菌量中区分出来：双抗体酶邻近反应实现大肠杆菌快速识别

大肠杆菌既是常见的食源性致病菌，也是饮用水和环境水中粪便污染的重要指示菌。对于食品安全和感染风险评估而言，检测到多少细胞并不等同于样品中存在多少实际风险：已经失活的细胞、细胞碎片或残留 DNA 仍可能被部分方法记录，而真正能够继续生长并造成危害的活菌才是需要优先识别的对象。传统培养法能够反映细胞活性，但通常需要 2–3 天；PCR 和 qPCR 虽然灵敏，却可能同时扩增死细胞来源的 DNA；免疫分析和侧向层析操作较为简便，但在复杂样品中仍可能受到洗涤步骤、可溶性抗原或细胞碎片的影响。因此，如何在缩短检测时间的同时保留活菌判别能力，仍是现场微生物监测中的一个实际问题。

本研究将此前用于病毒检测的 PULSERAA（Proximity-Unlocked Luminescence by Sequential Enzymatic Reactions from Antibody and Antibody/Aptamer）思路拓展到大肠杆菌检测。体系选择细胞表面的脂多糖（LPS）和外膜蛋白 C（OmpC）作为识别对象，分别配置两类抗体-酶复合物：一类是连接葡萄糖氧化酶（GOx）的抗 LPS 单链可变片段，另一类是连接辣根过氧化物酶（HRP）的抗 OmpC 抗体。两类复合物只有在同一完整细胞表面相互靠近时，才会形成有效的酶级联反应。GOx 先催化葡萄糖生成过氧化氢，邻近的 HRP 随后利用过氧化氢氧化鲁米诺并产生化学发光。这样，信号不只是来自抗体结合本身，而是来自两类识别事件在完整细胞表面的空间协同。

图1. PULSERAA 检测体系示意图。抗脂多糖（LPS）单链可变片段-葡萄糖氧化酶（GOx）复合物与 HRP 标记的抗外膜蛋白 C（OmpC）抗体只有在完整大肠杆菌细胞表面同时结合时才产生化学发光。在该条件下，GOx 将葡萄糖氧化为过氧化氢，邻近的 HRP 利用过氧化氢氧化鲁米诺并产生化学发光；当不存在活大肠杆菌或细胞结构被破坏时，GOx 与 HRP 保持分离，不产生明显化学发光。

研究人员首先验证了检测元件的构建和功能。通过 SpyCatcher/SpyTag 反应，将抗 LPS 单链抗体片段与 GOx 连接，随后利用流式细胞术确认复合物能够结合大肠杆菌，酶活性测试也显示其氧化酶功能得到保留。检测结果表明，加入大肠杆菌后，化学发光强度随细胞浓度增加而增强，在约 1–10⁴ CFU/mL 范围内与浓度对数呈近似线性关系。根据独立实验中的变化，计算得到的检出限约为 1.7–32 CFU/mL。浓度继续升高后，信号出现平台甚至下降，研究认为这可能与每个细胞可获得的抗体-酶复合物数量减少、细胞表面酶分子过度拥挤以及高浓度悬液对光信号的遮蔽有关。

图2. 检测元件的构建与功能评价。（a）通过 SpyCatcher（SC）/SpyTag（ST）反应确认 scFv-GOx 的形成；在还原条件下，GOx 为非共价同源二聚体，各组分以单体分子量位置迁移。（b）利用流式细胞术评价结合能力：大肠杆菌分别与 PBS 或 scFv-GOx 孵育，随后用 PE 标记的抗 His 抗体染色。

选择性实验进一步说明，信号生成依赖于正确的双重识别。将抗 LPS 片段替换为识别 SARS-CoV-2 无关抗原的片段后，体系几乎不产生大肠杆菌相关化学发光；对改造 LPS 的大肠杆菌以及革兰氏阳性菌蜡样芽孢杆菌进行检测时，信号也明显低于目标条件。更关键的是，当反应中缺少 GOx 供体或 HRP 受体，或其中的酶没有与抗体连接时，均未观察到有效化学发光。这些结果支持一种邻近依赖的级联机制：只有两种酶都被抗体带到同一完整细胞表面，反应链才会被有效启动。

活菌与死菌的区分是本研究的重点。活大肠杆菌表面保留了密集排列的 LPS 和 OmpC，可为两类抗体-酶复合物提供相邻结合位点；经 60 ℃、90 ℃ 热处理或乙醇处理后，细胞膜完整性和表面抗原排列受到破坏，两个酶复合物难以维持足够的空间接近。实验中，活菌产生了清晰的化学发光，而处理后的死菌只产生较低信号；60 ℃ 与 90 ℃ 处理组之间没有显著差异。由此可见，PULSERAA 的信号更接近“完整细胞表面是否仍保持可识别结构”，而不是简单累积细胞总量。

图3. PULSERAA 检测大肠杆菌及其选择性验证。（a）含 200 mM 葡萄糖和 24 ng/mL 过氧化氢酶的化学发光试剂用于大肠杆菌检测；（b）以识别无关抗原 SARS-CoV-2 的 scFv-GOx 替代抗 LPS scFv-GOx，评价检测选择性；（c）用于确认两类抗体-酶复合物均为必要组分的检测条件示意图；（d）比较 scFv-GOx + HRP-IgG、scFv-GOx + HRP、SC-GOx + HRP-IgG 和 SC-GOx + HRP 条件下的检测结果，数据表示为平均值 ± 标准差（n = 3）；（e）利用 PULSERAA 检测活大肠杆菌和死大肠杆菌，化学发光强度以活菌信号归一化为 1，数据表示为平均值 ± 标准差（n = 3）。

在食品基质验证中，研究人员使用商业牛奶进行加标实验。与空白牛奶相比，加入约 10⁵ CFU/mL 大肠杆菌的牛奶样品产生了清晰的化学发光差异，尽管牛奶中的信号低于 PBS 条件。研究认为，这种下降可能与乳成分对抗体结合、酶反应或传质过程的影响有关，但在当前实验条件下，样品中有无大肠杆菌仍能够被区分。论文还指出，体系在必要时可在 1 小时内完成检测，化学发光读出原则上能够适配简单光学检测器、ATP 生物发光仪或手机摄像头。

总体来看，本研究建立的 PULSERAA 平台把抗体的分子识别、完整细胞表面的空间组织和连续酶反应结合起来，在较短时间内对大肠杆菌进行化学发光检测，并提供了活菌与死菌的区分线索。当前证据主要来自培养的大肠杆菌、热处理或乙醇处理对照以及加标牛奶样品，尚不能等同于复杂食品、环境水或临床样本中的现场应用性能。后续仍需系统评估复杂基质干扰、真实样品中的回收率和稳定性，并检验该策略能否扩展到其他致病菌。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.bios.2026.118810