微流控等温扩增技术结合改良单叠氮丙啶策略应用于真实样本中6种活的食源性病原菌的快速检测

原创

来源：邹晶晶

2024-04-18 19:36:16

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核心提示：食源性致病菌对全球人类健康构成了重大威胁。分子生物学技术因其无需病原分离培养，检测周期短，灵敏度高已被广泛应用于病原诊断。尽管如此，此类检测技术面临着一个困境：无法区分活死细菌。另外，现有的大多分子诊断技术尚不具备多靶标同时检测能力。为此，Xiang等人基于离心式微流控发展了一种可编程环介导等温扩增技术（pLAMP），并引入了改良单叠氮丙啶（PMAxx）以实现实际样品中6种活的食源性致病菌的同时定量检测。

病原污染是全球每年爆发数百万食源性疾病病例的原因，对人类健康构成了重大威胁。例如，沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核增生李斯特菌和副溶血性弧菌的感染可引起腹泻、胃肠炎和败血症等严重疾病，而且这些病原往往同时存在于一个食物样本中。现已发展了不少病原诊断技术，主要有传统的病原分离培养和新进的分子生物学技术。前者能给出可靠的病原诊断结果，但是细菌培养周期较长;后者能够有效避免细菌的分离培养过程，但是面临一个困境：无法区分活/死细菌。另外，现今已发展了不少核酸扩增技术，以等温扩增技术(LAMP)应用最为突出。不过，LAMP技术往往涉及到4-6条引物，限制了在单一体系中进行多个靶标检测的应用。为此，Xiang等人基于离心式微流控发展了一种可编程环介导等温扩增技术(pLAMP)，并引入了改良单叠氮丙啶(PMAxx)以同时完成实际样品中6种活的致病菌(大肠杆菌O157：H7、蜡样芽孢杆菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌)的自动、快速、低成本定量检测。

研究所发展的多重检测策略——PMAxx-mpLAMP的检测原理可以概括为：1)线下细菌样本处理。PMAxx与细菌样品的有效混合是区分死菌和活菌的关键。在细菌样本输入芯片之前，将此样本与PMAxx染料共处理，在465 nm的强光照下，PMAxx穿过死细菌的细胞膜与其DNA发生共价交联反应，限制其后续核酸扩增。2)线上pLAMP扩增。将处理过的细菌样本引入微流控芯片，在相应区域完成DNA提取(95 ℃，5 min)，并利用Chelex-100树脂吸附样品中存在的杂质。随后，利用离心力将纯化的核酸溶液分散至5 μL的反应室，吸附杂质的Chelex-100树脂通过尺寸排除被保留在内圈中。然后，进行pLAMP扩增(63 ℃ 60 min)。pLAMP：利用FEN1和Bst DNA聚合酶在扩增反应中的协同效应，消除由阶梯状产物结构和非特异性荧光信号引起的假阳性结果;AuNPs作为单链DNA引物和聚合酶的载体，可以通过温度编程有效抑制错配和低温伪退火。3)荧光自动收集。在反应过程中，SYTO-9绿色染料被嵌入到DNA链中，发出荧光信号，配套仪器实时记录并分析各检测室等温扩增反应过程中的荧光信号。除样本前处理外，上述几乎所有步骤都在芯片中自动执行，且周期仅需90min(图1)。与该策略相匹配的圆形微流控芯片是一个高度集成的系统，可以自动进行核酸的纯化、分离、扩增和检测。4个功能模块与裂解室、废物池、微通道和8个检测室均匀分布在微流控芯片上，顺时针预装相应pLAMP试剂，依次为：大肠杆菌O157：H7、蜡样芽孢杆菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、阴性对照和阳性对照。

图1 PMAxx-mpLAMP原理示意图。

考虑到PMAxx在消除死细菌引起的假阳性信号的同时，还可能抑制后续的扩增反应，因而作者首先优化了PMAxx的处理浓度、光照强度及暴露时间和转速(图2)。随后，作者利用这6种目标菌和13种非目标菌表征了mpLAMP的特异性，并排除了芯片上的交叉污染干扰;也利用菌液10倍梯度稀释液表征了PMAxx-mpLAMP的灵敏度。6种目标菌的线性拟合曲线和荧光扩增曲线如图3所示，对于大肠杆菌O157：H7、蜡样芽胞杆菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌的动态检测浓度范围分别为：3.1×102~108，5.4×102~108，3.7×102~107，7.3×102 ~ 108，1.6×103~108和2.5×102~108 CFU/mL。r2值分布在0.95~0.98之间，表明Tt与细菌浓度呈良好的线性相关关系。然后，作者探讨了PMAxx-mpLAMP策略应用于食品样品中致病菌检测的可行性。通过在鸡肉样品中添加不同比例的活细菌，并将PMAxx-mpLAMP定量结果与平板计数、qPCR、PMAxx-qPCR和mpLAMP进行比较(图4)。结果显示，在仅接种107 CFU死细菌(目标)的鸡肉样本中，PMAxx-qPCR和PMAxx-mpLAMP结果与平板计数结果均为阴性，而qPCR和mpLAMP结果为6.72±0.33~7.17±0.18 Log CFU;当检测加入107 CFU活细菌的样品时，五种方法均显示出强烈的信号。由此证明，所建立的PMAxx处理可以有效地消除死亡细胞对真实样品检测的影响。在这里，为了进一步确定PMAxx-mpLAMP策略的优势，作者也探索了检测方法在高水平死细菌(107 CFU)和食品基质干扰背景下不同比例活细菌(107 CFU、105 CFU和103 CFU)的检测性能。结果显示，传统的核酸扩增方法(如qPCR和mpLAMP)，未能区分活细胞和死细胞(>6.74 log CFU)。PMAxx-mpLAMP在高、中、低浓度活细胞样本上的结果存在显著差异，表明这两种方法具有量化真实样本中活细胞的能力。不过，在活细菌浓度分别为105 CFU和103 CFU时，PMAxx-mpLAMP的检测效率明显受到影响，甚至无法检测到大肠杆菌O157：H7和金黄色葡萄球菌。对于添加103 CFU活细菌的样品，其余4种细菌的PMAxx-mpLAMP结果分别为：2.54±0.11(蜡样芽孢杆菌)、1.94±0.09(单增李斯特)、2.44±0.05(沙门氏菌)和2.74±0.14(副溶血性弧菌)log CFU。这些结果证明了基于芯片的pLAMP(5 μL)的定量能力(与大体积qPCR定量结果基本一致)。不过，也显示了食品基质对PMAxx-mpLAMP定量能力的干扰，这在一定程度上限制了该策略在真实样品中的直接应用。

对于上述存在的问题，作者提出的解决方案是增加一个细菌富集过程，以确保PMAxx-mpLAMP能够最大限度地检测致病菌。结果显示，随着富集时间的延长，Tt值逐渐下降。当富集时间达到6 h时，所有Tt值均低于30 min，大致相当于103或104 CFU细菌(图5A)。最后，作者通过往3种食品基质(巴氏杀菌奶、生虾和鸡肉)中添加101 CFU多目标活菌探讨了PMAxx-mpLAMP的多重检测能力。结果显示，PMAxx-mpLAMP准确检测了加入三种不同组合活菌溶液的三个样品(图5B)。

总之，本研究开发了一种应用于食品样品中6种常活菌病原高通量定量检测的PMAxx-mpLAMP检测技术，此技术具有高通量活菌定量能力，在定量检测食源致病菌上具有很强的应用潜力。