一种用于霍乱弧菌荧光检测的高效 DNAzyme

  霍乱弧菌(Vc) 会引起霍乱病。Vc 污染广泛存在于水和水产品中，因此是一个严重的食品安全问题，特别是对于海产品行业。我们使用未修饰的 DNA 文库成功进行了九轮体外选择，以找到 Vc 的特定 DNAzyme。基于荧光测定和凝胶电泳评估它们的活性。最后，选择一种具有良好活性和特异性的 DNAzyme(命名为 DVc1)，检测限为7.2 × 10 3 CFU/mL Vc。通过使用普鲁兰多糖和海藻糖将 DVc1 及其底物固定在 96 孔板的浅圆形孔中，构建了一个简单灵敏的生物传感器。将粗制的Vc胞外混合物加入检测孔中，20分钟内即可观察到荧光信号，证明其可作为一种快速的现场 Vc 检测工具。

  霍乱是一种频繁暴发和高死亡率的致命传染病，每年影响数百万人，造成数万人死亡。霍乱弧菌(Vc)是一种革兰氏阴性菌，属于弧菌属，可引起霍乱。早期检测Vc污染有助于预防疾病，目前的Vc检测方法之一是细胞培养，需要更长的时间，因此不适合处理多个样品。基于免疫学的Vc检测方法包括ELISA，免疫荧光技术，胶体金检测技术和斑点杂交技术，然而这些方法繁琐，假阳性高，灵敏度低。新型Vc检测方法包括基于核酸的聚合酶链反应(PCR)和等温扩增技术，但需要设备和训练有素的人员。因此需要一种简单快速的检测方法。

  功能核酸(FNA)是一类可替代传统蛋白酶及抗体，具有独立结构和分子识别能力，执行特定生物功能的核酸分子的统称，例如DNA酶，它是具有底物识别能力的短单链催化DNA分子。RFD可用于建立简单的“混合和读取”细菌检测测定，其中荧光信号确认目标细菌的存在。RNA切割DNA酶可以与荧光报告基团(称为RNA切割荧光DNA酶，RFD)连接，以在与适当靶标结合时产生荧光信号。在这项工作中，RFD的催化结构域由35个脱氧核糖核苷酸组成，两侧是两个底物识别结构域，分别是20和12个碱基。含有核糖核苷酸的底物切割位点嵌入RFD DNA序列中。此外，RFD在DNA酶的5'底物结合端具有荧光团，在3'端具有淬灭剂。荧光在没有靶标或浓度非常低的情况下被淬灭，然而，一旦靶标在金属离子的帮助下与DNA酶结合，底物就会被裂解，释放淬灭基团，从而产生荧光信号。

  已经筛选了几种DNA酶的高亲和力，与特定靶分子的选择性结合，以及体外应用的其他催化功能。DNA酶催化功能可以将分子相互作用转化为可见信号(发光或颜色变化)。DNA酶的大小可以从20到100多个核苷酸。DNA酶具有化学和热稳定性，可以轻松合成。此外，可以修改DNA酶的内部碱基或端子以提供额外的功能。

  2011年，Ali等人设计了一种使用未纯化的CEM检测特定细菌的新方法。从随机序列DNA文库中筛选的荧光标记DNA酶用于构建简单的混合和读取细菌测定。更重要的是，该方法可以检测单个活细胞，绕过繁琐耗时的探针分离和后续分析过程。第一个靶向细菌活性DNA酶是RFD-EC1。在这项研究中，通过磁珠法筛选了DNA酶，使用针对其他七种细菌的CEM-Vc和CEM的阳性和天然筛选。这显着提高了我们的DNA酶(DVc1)的特异性，它是根据一系列筛选，测序，切割活性和特异性比较测定选择的。

  在营养条件下生长并与环境交换物质的能力是活细胞的独特特性。微生物留下小分子或大分子的混合物作为CEM。从CEM中纯化和识别合适的靶标用于生物传感器开发过于费力，昂贵且困难。最近的研究直接使用细菌CEM作为筛选DNA酶的多个靶标。CEM 可能含有潜在的生物标志物，例如蛋白质、核酸、脂质和多糖。研究表明，蛋白质是CEM中DNA酶的主要靶标。因此，我们对CEM-Vc进行了蛋白质降解，发现它未能激活DNA酶，表明DVc1的靶标确实是一种蛋白质。此外，过滤筛选测定表明它可以是>50 kDa的蛋白质。

  综上所述，我们在体外成功筛选了一种针对Vc的特定DNA酶DVc1并研究了其特性，以成功构建了一种简单的基于DNA酶的生物传感器，用于Vc的快速检测。该传感器在pH 8和DVc1浓度为200 nM时具有良好的灵敏度和特异性，传感器的检测限较低为 7.2 × 103CFU/mL Vc，在20 min内在生即食牡蛎中成功检测到1.28 × 102CFU/mL的Vc，与其他Vc检测方法相比，可以更方便、快速和简单地进行Vc的现场检测，帮助海鲜行业及时检测Vc污染。

  参考文献：Miao, Q., Ding, W., Bao, X., Wang, S., Lin, Q., Xu, Y., Lu, J., Lyu, M., & Wang, S. (2023). An efficient DNAzyme for the fluorescence detection of Vibrio cholerae. Food Science & Nutrition, 11, 3235–3245.