规避毒株变异捕获难题：基于 Vero 细胞的 H7N9 流感病毒纯流通过程色谱纯化新工艺

一、 行业痛点与传统纯化工艺的局限性

流感病毒每年造成全球数十万人死亡，接种疫苗是预防流感最有效的手段。传统鸡胚生产体系存在产能受限于 SPF 鸡胚供应、易发生禽适配突变以及鸡卵清蛋白过敏等隐患。基于 Vero 细胞的无血清培养体系已被 WHO 推荐为鸡胚替代方案，其表达的血凝素（HA）糖基化修饰更接近人类真实感染病毒。

然而，在下游纯化环节，传统工艺普遍面临瓶颈：

核酸酶成本高昂：利用 Benzonase 等核酸酶消化宿主 DNA 会显著增加生产成本和处理时间。

变异导致捕获失效：采用亲和色谱（如硫酸纤维素 CSC 或凝集素色谱）属于“捕获病毒”模式，但流感病毒每年均会发生抗原漂移或重配，表面抗原的改变常导致原捕获工艺失效，必须每年重新优化色谱参数。

为了解决上述难题，开发一种不依赖特定毒株、能高效结合并排除杂质的流通过程色谱（Flow-through chromatography）成为行业升级的迫切需求。

二、 纯流通过程色谱的组分设计与技术原理

研究团队巧妙地利用流感病毒粒子巨大（80–120 nm）而宿主杂质分子较小的物理特性，设计了“300 kDa 交叉流超滤 + UniGel-30Q（强阴离子交换） + Capto Core 700（配体激活核心色谱）”的组合工艺：

300 kDa 超滤浓缩：在无血清收获液灭活后直接进行 100 倍超滤浓缩，不仅替换了上样缓冲液，且仅此一步即去除了高达 80.51% 的宿主残余 DNA。

UniGel-30Q 流通脱 DNA：在 pH 6.8–7.4、500 mM NaCl 的上样条件下，表面带负电荷的残余 hcDNA 被强阴离子交换介质牢牢吸附，而病毒粒子直接流出，实现 90.67% 的步骤 DNA 清除率。

Capto Core 700 流通脱宿主蛋白：Capto Core 700 具有“分子筛外壳+内部多模态配体”结构。外壳孔径截留分子量为 700 kDa，阻挡巨大的流感病毒粒子直接流出；而小于 700 kDa 的宿主蛋白（HCP）和 BSA 则穿过外壳进入内部，被里面的疏水及带正电配体高效结合捕获，实现 77.68% 的步骤 HCP 清除率。

Fig. 纯化后 H7N9 流感病毒（A/Shanghai/2/2013 Va）的透射电子显微镜（TEM）图像

三、 杂质清除效果与药典符合性评估

通过对 20 个细胞工厂（Cell Factory）规模收获的 H7N9 病毒液进行全流程纯化，相关指标全面优于《中国药典》和 WHO 标准：

四、 上游无血清培养与 downstream 纯化的协同增效

本研究所取得的高纯度与高回收率，很大程度上得益于上游无血清培养技术的应用。在病毒增殖阶段采用无血清维持液，不仅避免了血清对 TPCK-胰蛋白酶活性的抑制，且从源头上消除了大量血清杂蛋白的引入，极大地降低了下游纯化负担。

在下游质控和表达分析中（如采用单向免疫扩散法 SRID 测定 HA 含量、Lowry 法测定总蛋白以及定量 PCR 检测 Vero 细胞 172 bp LTR 特异性序列），极低的残余背景噪声保证了数据的极高重现性与准确度。

针对国内生物制品企业的现代化升级，在下游引入自动化 AKTA 系统与多模态流通过程色谱介质的同时，上游搭配如 广东环凯（Huankai） 等企业生产的高品质细胞培养基原料及无血清培养试剂，能够进一步保证细胞生长与病毒表达的批次稳定性，从而构建“上游高密度无血清表达 + 下游通用型纯流色谱”的现代化疫苗高效生产平台。

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参考文献：

Fei, C., Gao, J., Fei, C., Ma, L., Zhu, W., He, L., Wu, Y., Song, S., Li, W., Zhou, J., & Liao, G. (2022). A flow-through chromatography purification process for Vero cell-derived influenza virus (H7N9). Journal of Virological Methods, 301, 114408. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2021.114408