基于Lpp信号肽锚定的工程化OMVs递送系统：鸭疫里默氏杆菌多抗原疫苗平台的免疫原性与保护效力研究

背景知识

RA是一种革兰氏阴性菌，主要感染鸭、鹅等水禽，近年来在鸡群中亦呈蔓延趋势，不仅造成养殖业的重大经济损失，还可能通过禽肉加工污染威胁食品安全。目前已鉴定出21种RA血清型，其中血清型1型和2型致病性最强，且不同血清型之间交叉保护性差，使得现有疫苗防控效果有限。与此同时，RA对抗生素的耐药性日益普遍，迫使研究者将目光投向新型疫苗策略。外膜蛋白（outer membrane proteins, OMPs）位于菌体表面，具有良好的免疫原性和可及性，是亚单位疫苗的理想靶标；其中YaeT因序列保守、免疫反应广泛而被视为具有交叉保护潜力的核心抗原，PorQ与YiaD亦被证实可诱导保护性免疫。然而，重组蛋白疫苗通常依赖外源佐剂才能激发足够强的免疫应答。细菌外膜囊泡（OMVs）是革兰氏阴性菌自然分泌的纳米级双层膜结构（直径30–250 nm），富含脂多糖（LPS）、OMPs等病原体相关分子模式（PAMPs），可模拟天然病原以激活先天与适应性免疫，因而被视为极具潜力的自佐剂疫苗递送载体。Lpp（Braun脂蛋白）是外膜中丰度极高的脂蛋白，其游离型约占总量三分之二，C末端暴露于膜表面；利用其N端信号肽可将异源抗原导向细菌外膜及OMV表面，从而增强抗原呈递效率。基于上述原理，本研究旨在建立一种Lpp介导的OMV表面展示系统，评估其在鸭模型中对RA感染的免疫保护效力。

研究方法

研究首先通过等位基因交换法构建工程化沙门氏菌RAST0013（ΔrfbPΔfliCΔfljBΔompA），以敲除O抗原合成、鞭毛蛋白及外膜蛋白A等基因，从而增强OMV产量、减少非目标免疫刺激并优化膜稳定性。随后，以RA-SD-1基因组DNA为模板，扩增yaeT、porQ、yiaD基因，并将其无缝克隆至含Lpp信号肽与His标签的pBAD33-lpp表达质粒，转化入工程菌；经0.2%阿拉伯糖诱导后，通过差速离心、0.45 μm过滤、150,000×g超高速离心及OptiPrep密度梯度离心提取纯化OMVs。利用透射电镜（TEM）与纳米颗粒追踪分析（NTA）表征OMV形态、粒径分布与浓度，BCA法测定蛋白产量，Western blot（抗His标签抗体）验证抗原表达。安全性评价采用LDH释放法检测OMVs对小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性，并以1日龄樱桃谷鸭为模型，肌肉注射100 μg OMVs后连续监测28天体增重。免疫保护实验设5组（PBS对照、空载体Lpp-OMVs、Lpp-YaeT、Lpp-PorQ、Lpp-YiaD），每组20只鸭，于0天首免、14天加强免疫，28天以5×LD₅₀的RA-SD-1攻毒，观察14天生存率。分别于首免后7天与加强免疫后7天采血，间接ELISA检测血清抗原特异性IgY水平；加强免疫后7天分离外周血单个核细胞（PBMCs），以重组抗原体外刺激72 h，CCK-8法测定淋巴细胞刺激指数（SI）；同时以qRT-PCR检测刺激后PBMCs中Th1型（IFN-γ、TNF-α）与Th2型（IL-4、IL-6）细胞因子mRNA表达。攻毒后第2、4天剖杀部分鸭只，取心、肝组织匀浆涂板计数CFU以评估细菌定植；实验结束时对所有组织进行H&E染色病理学观察并按标准评分。

研究结果

提取的OMVs呈典型双层球形结构，粒径主要集中在130–150 nm，抗原负载未显著影响OMV产量（约1.64 mg/100 mL培养物）。Western blot在Lpp-YaeT、Lpp-PorQ、Lpp-YiaD组分别检测到约40 kDa、35 kDa、25 kDa的特异性条带，而空载体组无信号，证实三种抗原均成功整合至OMVs。安全性方面，工程化OMVs（10 μg与25 μg）未引起RAW264.7细胞LDH释放显著升高，且免疫鸭只的体重增长与PBS对照组无显著差异，表明该疫苗平台具有良好的体内外安全性；而野生型沙门氏菌OMVs则表现出明显细胞毒性。免疫原性结果显示，三种抗原展示OMVs均能在首免及加强免疫后诱导显著高于对照组的特异性IgY抗体应答，加强免疫后滴度进一步攀升。细胞免疫层面，抗原展示组PBMCs在体外再刺激后表现出强烈的抗原特异性淋巴细胞增殖（SI显著升高），且Th1型与Th2型细胞因子mRNA表达水平均显著上调，提示工程化OMVs可激活全面的辅助性T细胞应答。攻毒保护实验中，抗原展示组心、肝细菌载量在攻毒后第2天已显著低于PBS与空载体对照，第4天进一步降低，显示高效的细菌清除能力；YaeT与YiaD组存活率为80%，PorQ组为70%，而PBS与空载体对照组在观察期内全部死亡。病理学检查表明，PBS对照组心、肝出现严重的纤维素性渗出、肝细胞坏死、心肌纤维变性及炎性细胞浸润；YaeT免疫组病变最轻，心、肝表面几乎无黄色渗出物，组织学结构基本完好，病理评分显著低于其他各组，YiaD与PorQ组亦呈现中度保护效果。

图 工程化沙门氏菌OMVs表面展示鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白诱导强烈的抗原特异性IgY体液免疫应答

结论与意义

本研究成功构建了一种基于工程化沙门氏菌OMVs的Lpp表面展示疫苗平台，证实其可高效递送RA外膜蛋白抗原并诱导强烈的体液与细胞免疫应答，从而对高毒力RA血清型2型感染提供显著保护。在三种候选抗原中，YaeT展现出最优的免疫原性与保护效力，存活率高达80%，且能最大程度减轻心、肝病理损伤与细菌负荷，提示YaeT可作为RA广谱疫苗开发的核心候选抗原。该OMV平台兼具自佐剂效应与良好的生物安全性，避免了传统重组蛋白疫苗对外源佐剂的依赖；同时，通过基因工程手段敲除沙门氏菌毒力相关基因并优化OMV产量，进一步提升了平台的实用性与规模化生产潜力。研究不仅为RA的防控提供了新型亚单位疫苗策略，也为将OMV技术拓展至其他禽类病原（如多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌等）的多价疫苗开发奠定了理论与技术基础。未来研究需进一步评估YaeT-OMVs对多种RA血清型的交叉保护能力，并通过长期免疫记忆监测、黏膜免疫途径优化及更系统的毒理学评价，推动该疫苗平台向临床转化应用迈进。

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参考来源：Zhou G, Zhang Z, Luo Z, Cao S, Li Y. 2026. Salmonella-derived OMVs as a vaccine platform for Riemerella anatipestifer outer membrane proteins to prevent infection in ducks. Appl Environ Microbiol 92:e00608-26.