悬浮驯化 Vero 细胞平台构建：高效扩增牛结节性皮肤病病毒新工艺研究

一、研究背景

LSDV 是痘病毒科危害牛羊的跨境重大疫病，全球持续扩散，疫苗是核心防控手段；现有疫苗依赖贴壁 Vero 细胞制备，操作繁琐、产能受限，且传统含血清培养基存在批次差异、外源污染、生产成本高等问题。

悬浮细胞适配生物反应器放大，是兽用病毒疫苗工业化主流方向，但市面无商品化悬浮 Vero 细胞，本研究自主驯化悬浮 Vero（Vero-S）细胞，搭建适配 LSDV 的小规模培养体系，为反应器工业化奠定基础。

二、试验材料与方法

a) Vero 细胞悬浮驯化：以贴壁 Vero 为原始株，逐步降低血清、搅拌传代驯化，采用 5% 低血清 DMEM 培养基，调控搅拌转速 80–120 rpm、pH 7.4–7.8，连续传 12 代获得稳定悬浮细胞株；全程无菌检测（硫乙醇酸盐肉汤、沙堡琼脂、胰酪大豆肉汤）无杂菌、支原体污染，并建立 12 代细胞主种子库，冻存复苏后活力稳定。

b) 细胞生长参数测定：台盼蓝染色计数，记录细胞密度、活率、倍增时间，计算生长动力学；倒置显微镜观察细胞聚集与形态。

c) 病毒感染对比试验：统一 MOI=0.1 分别感染悬浮 Vero、传统贴壁 Vero，34℃培养，分时段取样；通过细胞病变（CPE）、荧光定量 qPCR、TCID₅0 滴度、透射电镜四项手段对比两种细胞的病毒复制能力。

三、核心试验结果

悬浮 Vero 驯化成功：经 12 代驯化细胞可稳定悬浮生长，峰值活细胞密度达 1.94×10⁶ cells/mL，细胞倍增时间 46 h；驯化前期 7 代细胞活力短暂下降，8 代后持续回升，细胞团聚可控，冻存复苏后形态、增殖性能无明显改变。

LSDV 复制能力显著优于贴壁细胞

1.  细胞病变：悬浮细胞感染后病毒致病变更剧烈；

2. qPCR 定量：悬浮细胞 Ct 值仅 18，对应病毒基因组拷贝 1.6×10⁶，贴壁细胞 Ct27.5、拷贝仅 2×10³，病毒载量差距极大；

3. 病毒滴度：感染 96 h 后悬浮细胞 TCID₅0 达 6.85 log₁₀/mL，贴壁细胞仅 5.5 log₁₀/mL；

图 1 贴壁 Vero 细胞与悬浮驯化 Vero 细胞培养牛结节性皮肤病病毒（LSDV）96 h 峰值 TCID₅₀滴度对比。

4.  透射电镜可在悬浮细胞内观察典型哑铃形 LSD 病毒颗粒。

图 2 透射电镜观察悬浮 Vero 细胞内牛结节性皮肤病病毒增殖。病毒大量复制引发细胞坏死，病毒颗粒自细胞膜出芽，并在细胞膜附近聚集。

5. 工艺优势：低血清体系减少血清相关污染与批次波动，悬浮模式搅拌供氧均匀、营养传递充分，适配分批、灌流等强化放大工艺。

四、讨论与结论

讨论：贴壁 Vero 传代繁琐、依赖高血清；本研究分步降血清 + 梯度搅拌驯化方案可稳定获得悬浮 Vero，细胞耐受搅拌剪切，代谢环境更均衡，病毒复制效率大幅提升；驯化中期细胞活力低谷是细胞应激筛选的正常现象，存活亚群形成稳定悬浮表型。

研究结论：自主驯化的悬浮 Vero 细胞可高效扩增 LSDV，病毒滴度、基因组载量均显著高于传统贴壁培养，工艺可控、成本更低，具备生物反应器规模化生产潜力；但本研究仅完成摇瓶小试，后续需开展生物反应器放大试验、完整工艺验证，满足兽药监管生产规范。

五、研究价值

1. 技术层面：提供 Vero 细胞悬浮驯化完整操作方案，为牛结节病兽用疫苗工业化生产提供新工艺路线；

2. 行业延伸：该悬浮驯化思路可迁移至其他痘病毒、兽用病毒疫苗细胞培养平台开发。 

参考来源：Mossa HM, Eid S, El-Said AA, Yousif AA, El-Sanousi AA. Development of a suspension-based vero cell culture platform for the efficient propagation of lumpy skin disease virus. Open Vet J. 2026 May;16(5):3039-3051. doi: 10.5455/OVJ.2026.v16.i5.46. Epub 2026 May 31. PMID: 42375428; PMCID: PMC13313818.