多表位环状RNA疫苗展现犬冠状病毒Ⅱ型防护潜力：从免疫设计到犬攻毒验证

犬冠状病毒（CCoV）是一类重要的犬肠道病原，其中CCoV-II是目前广泛流行的基因型之一，幼犬及免疫功能较弱的犬感染后容易出现胃肠道症状。病毒表面的刺突蛋白（Spike protein，S蛋白）负责病毒吸附和进入宿主细胞，也是诱导中和抗体的关键抗原。然而，S蛋白具有较高的遗传变异性，特别是部分区域容易发生抗原漂移，因此，如何针对相对保守且具有免疫原性的区域进行精准设计，是提高疫苗保护范围的重要方向。

此次研究以近期分离的CCoV-II WH2023株为基础。系统发育和序列分析显示，该毒株与近年来流行的CCoV-II谱系具有较高相关性，研究人员据此将其S蛋白作为疫苗抗原设计的基础。随后，研究团队利用免疫信息学方法，从S蛋白中分别筛选细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、辅助性T淋巴细胞（HTL）以及线性B淋巴细胞（LBL）表位，并综合考虑MHC结合能力、抗原性、免疫原性、毒性和致敏性等指标，最终将多个候选表位组合形成多表位抗原序列。研究共筛选获得6个CTL表位、5个HTL表位和8个LBL表位，以期同时调动细胞免疫和体液免疫。

图1 CCoV-II WH2023菌株的遗传特征与系统发育分析

与传统线性mRNA不同，circRNA呈共价闭合环状结构，没有游离的5′端和3′端，因此对外切核酸酶降解具有较强耐受性，有望延长RNA在细胞内的稳定时间和抗原表达持续时间。本研究进一步使用脂质纳米颗粒（LNP）包裹circRNA，并分别构建多表位S蛋白疫苗ME-S和全长S蛋白疫苗FL-S。颗粒表征显示，两种LNP制剂粒径分布较均一，约为100 nm；Western blot结果则证实两种circRNA均能够在细胞中有效表达相应抗原。ME-S和FL-S circRNA的环化效率分别达到85.64%和78.74%。

图2 ME-S和FL-S环RNA–LNP疫苗的设计、特性分析及体外验证

在免疫原性评价中，两种circRNA疫苗均表现出较强的抗体诱导能力。小鼠接种后产生持续的S蛋白特异性IgG和病毒中和抗体，同时伴随滤泡辅助性T细胞（Tfh）和生发中心B细胞（GC B细胞）反应增强。研究还在骨髓中检测到较高比例的长寿命浆细胞，提示疫苗可能有利于建立较持久的体液免疫。多表位ME-S疫苗在部分早期时间点表现出更快的免疫应答。犬模型中也观察到了类似结果，ME-S和FL-S均可产生持续的S蛋白特异性IgG和中和抗体，而ME-S在免疫后第2周的抗体水平相对更高。

细胞免疫方面，疫苗接种后小鼠脾细胞和犬外周血单个核细胞经抗原再次刺激后均表现出明显的IFN-γ分泌，而IL-4水平相对较低，整体呈现以Th1型反应为主的免疫特征。研究人员认为，多表位设计中特别纳入HTL表位，有助于促进T细胞应答以及Tfh—GC B细胞轴的形成，从而进一步支持高质量抗体反应。

更为关键的是犬攻毒试验。免疫6周后，研究人员使用强毒CCoV-II WH2023株对犬进行挑战。未免疫对照犬在攻毒后第2～5天持续检测到病毒排出，并在第3～4天达到约10⁵ copies/mL；相比之下，两组circRNA疫苗免疫犬在观察期内仅检测到极低水平或未检测到明显病毒排出。对照组犬在攻毒后第3～8天的临床评分持续超过发病阈值，同时出现发热和体重下降，而疫苗接种犬整体保持较稳定的体温、体重和临床状态。

肠道组织学结果进一步验证了疫苗的保护作用。攻毒后第4天，对照犬空肠和回肠可见明显绒毛坏死、黏膜出血等病理改变，而免疫犬肠绒毛结构总体保持完整，炎性细胞浸润也明显减少，说明该疫苗不仅能够降低病毒复制和排出，还能够减轻CCoV-II感染造成的靶器官损伤。

图3 对犬类致病性CCoV-II挑战的保护作用 

安全性方面，接种犬在观察期间体温保持在正常范围，注射部位组织学检查未见明显坏死或持续性炎症。血清IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性指标也未显示明显的系统性炎症异常，其中多表位ME-S组的部分炎症指标低于研究设置的商业疫苗对照组。整体结果表明，该circRNA-LNP疫苗在当前动物试验条件下表现出较好的耐受性。

需要指出的是，这项研究仍属于临床前阶段。攻毒试验仅采用了一株CCoV-II毒株，犬模型每组样本量也较有限，因此目前还不能据此判断其对不同地区、不同遗传谱系CCoV-II的广谱保护效果。此外，研究的免疫观察时间主要集中在6周左右，更长期的免疫记忆持续时间仍有待验证；商业疫苗虽然用于部分免疫原性和安全性比较，但并未纳入攻毒保护试验进行直接对照。作者认为，后续还需要扩大流行毒株覆盖范围、延长随访时间，并进一步优化疫苗剂量及免疫程序。

总体来看，该研究将保守多表位筛选、circRNA表达平台和LNP递送技术结合起来，并完成了从体外表达、小鼠免疫评价到犬攻毒保护的较完整验证。结果表明，多表位circRNA疫苗能够同时诱导中和抗体和细胞免疫，并在犬模型中降低病毒排出、临床发病和肠道损伤。虽然距离实际兽用疫苗产品仍需经过更大规模、更多毒株和更长期的安全性与有效性评价，但这项工作为犬冠状病毒疫苗的精准抗原设计以及circRNA技术在兽医疫苗领域的进一步开发提供了新的研究基础。

参考来源：Zhang X, Wang L, He W, Ren Z, Zhang C, Zhou M, Wan J, Zhao J, Zhao L. Design and preclinical evaluation of a multi-epitope circular RNA vaccine targeting the spike protein of canine coronavirus genotype II. Vet Microbiol. 2026 Aug 9;321:111188. doi: 10.1016/j.vetmic.2026.111188. Epub ahead of print. PMID: 42579946.