“一苗三防”：表达H5与H7血凝素基因的重组鸭肠炎病毒活疫苗构建及广谱保护效力研究

背景知识

禽流感病毒，特别是H5和H7亚型，持续对全球家禽业和公共卫生构成严重威胁。自2003年以来，H5病毒HA基因已演化为10个不同的进化分支，其中clade 2.3.2和2.3.4.4系列病毒已跨洲传播，造成数亿只家禽死亡和大量人类感染。2013年出现的H7N9病毒曾引发五波人类感染疫情。尽管自2017年起中国实施H5/H7二价灭活疫苗免疫策略有效控制了H7N9疫情，但鸭子养殖面临特殊困境：许多对鸡高度致死的禽流感病毒在鸭体内仅引起无症状感染，导致养殖户缺乏为鸭群接种禽流感灭活疫苗的动力。大量未免疫的开放饲养鸭子成为野鸟与家禽之间的“特洛伊木马”，在禽流感病毒传播链中扮演关键角色。另一方面，鸭肠炎病毒（DEV）是一种对鸭100%致死的疱疹病毒，其减毒活疫苗自1960年代以来已被广泛使用。因此，利用DEV活疫苗载体表达禽流感病毒HA基因，开发一种能同时预防DEV和禽流感的多价活疫苗，成为解决鸭子免疫覆盖不足和切断病毒传播链条的重要策略。

研究方法

研究首先利用重叠fosmid DNA系统，将三个HA基因表达盒分别插入DEV基因组的三个非必需区域（sorf3与us2之间、us7与us8之间、us8与us1之间），构建重组fosmid T-dH5/H7，并通过与覆盖DEV全基因组的其余四个fosmid（D、H、J、Q）共转染鸡胚成纤维细胞（CEFs）拯救重组病毒rDEV-dH5/H7。通过PCR、测序、免疫荧光和WB验证外源基因的插入与表达。为评估遗传稳定性，将重组病毒在CEFs中连续传代15次并进行PCR和蛋白表达检测；通过一步生长曲线比较其与亲本疫苗株的复制特性。动物实验使用263只2周龄SPF绍兴麻鸭，通过肌肉注射接种不同剂量的rDEV-dH5/H7或亲本疫苗株vDEV，并在特定时间点用100 DLD50的致死性DEV或10^6 EID50的禽流感病毒进行攻击，观察临床症状、死亡率，并采集咽和泄殖腔拭子进行病毒分离滴定。血清学检测采用HI试验测定抗禽流感抗体，采用中和试验（NT）测定抗DEV抗体。

研究结果

研究成功拯救了rDEV-dH5/H7，免疫荧光证实三种HA蛋白在感染细胞中均能有效表达。该重组病毒在CEFs中传代15次后，三个HA基因仍能稳定存在并表达，且其生长曲线与亲本vDEV基本一致，表明外源基因插入不影响病毒复制。在抗DEV保护实验中，接种10⁴和10⁵ TCID50 rDEV-dH5/H7的鸭子在免疫后1周或2周攻击时均获得100%保护，保护效力与vDEV相当；即使在单次低剂量（10³ TCID50）免疫后，也能提供部分保护。在抗体反应方面，采用2、5、16周龄三剂免疫程序，鸭子在首剂后仅产生低水平HI抗体，第二剂后HI抗体滴度急剧上升（均值>6.2 log₂），第三剂后达到峰值（7.6–8.0 log₂），并在40周龄时仍维持在约4.6 log₂的保护水平；抗DEV中和抗体动态与vDEV组相似。攻毒保护试验显示，两剂rDEV-dH5/H7免疫后可对同源H5N6、H5N1和H7N2病毒攻击实现完全保护，所有免疫鸭存活且无病毒脱落；单剂免疫后2周，对2020–2021年流行的异源H5N6（clade 2.3.4.4h）、H5N1（clade 2.3.2.1d）和H5N1（clade 2.3.4.4b）病毒攻击同样实现完全保护，有效阻止了病毒复制和传播。

图1 重组鸭肠炎病毒rDEV-dH5/H7在体外的遗传稳定性、外源蛋白表达稳定性及复制特性

结论与意义

这项研究证明，DEV载体能够耐受多个外源HA基因的同时插入并保持稳定的免疫原性，是构建多价活疫苗的理想平台。rDEV-dH5/H7不仅能替代现有DEV活疫苗预防鸭病毒性肠炎，还能同时诱导针对多种H5和H7禽流感病毒的广谱保护性免疫，且仅需单次免疫即可在1周内快速建立对异源毒株的完全保护。在当前野鸟迁徙导致禽流感病毒跨区域传播的背景下，将rDEV-dH5/H7纳入养鸭业的常规免疫程序，是一种经济高效的“一苗多防”策略。它既能解决养殖户对单独禽流感疫苗接种积极性不足的问题，提高鸭群整体免疫覆盖率，又能有效阻断野鸟来源的H5和H7病毒经鸭子向家禽和人类传播的链条，对禽流感的综合防控具有重要的公共卫生意义和应用前景。

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参考来源：Yujie Hou, Guohua Deng, Pengfei Cui, Xianying Zeng, Bin Li, Dongxue Wang, Xinwen He, Cheng Yan, Yaping Zhang, Jiongjie Li, Jinming Ma, Yanbing Li, Xiurong Wang, Guobin Tian, Huihui Kong, Lijie Tang, Yasuo Suzuki, Jianzhong Shi & Hualan Chen. (2024) Evolution of H7N9 highly pathogenic avian influenza virus in the context of vaccination. Emerging Microbes & Infections 13:1.