从田间强毒到高效疫苗：基于CEF细胞培养的印度株鸭瘟减毒活疫苗研制及其完全保护效力的验证

背景知识

鸭瘟（又称鸭病毒性肠炎）是由鸭肠炎病毒（DEV）引起的一种急性、高度接触性、致死性传染病，主要感染鸭、鹅、天鹅等雁形目鸟类，给全球水禽养殖业造成重大经济损失。DEV属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科，为双链DNA病毒。目前印度商业使用的疫苗是1979年引进的荷兰Jansen株鸡胚适应活疫苗，但该疫苗存在生产流程繁琐、批次间滴度难以控制、含有鸡胚组织等异源蛋白以及抗原性与本地流行株匹配度不足等问题，导致免疫失败和疫情暴发的报道时有发生。因此，利用本地流行株开发一种成分纯净、适合工业化大规模生产的细胞培养疫苗具有重要的现实意义。

研究方法

研究首先将分离自印度喀拉拉邦的DEV/India/IVRI-2016强毒株在鸭胚中传15代，继而在鸭胚成纤维细胞（DEF）中传15代，最后适应于CEF细胞并连续传代至第41代以获得减毒株。通过PCR检测DNA聚合酶基因和间接免疫荧光试验确认病毒在CEF中的增殖与定位，并绘制P35代的生长动力学曲线。随后，按照印度药典标准对P41代疫苗株（DPvac/IVRI-19）进行系统的安全性评价（10倍剂量接种）、返毒试验（鸭体内连续回传6代）以及免疫效力试验。免疫试验将75只8周龄鸭雏分为5组，分别接种10^2.5至10^5.5 TCID₅₀四种不同剂量的疫苗，通过病毒中和试验（VNT）、淋巴细胞增殖试验（MTT法）及流式细胞术检测CD4+和CD8+ T细胞水平来评估体液与细胞免疫应答。在免疫后21天，分别用10²和10³ DLD₅₀的强毒进行攻毒，观察保护率并检测泄殖腔病毒排毒情况。最后，对疫苗株和亲本强毒株进行全基因组测序与系统发育分析。

研究结果

DEV在CEF细胞中成功适应并稳定增殖，传代后细胞病变效应（CPE）出现时间从96小时缩短至48–72小时，第41代病毒滴度达到10^7.5TCID₅₀/mL。安全性试验表明，接种10倍剂量疫苗的鸭雏在21天内无任何临床症状或死亡；连续回传6代后仍未出现毒力返强，证明其遗传稳定性良好。免疫学检测显示，接种10^3.5 TCID₅₀及以上剂量的鸭雏在21天时产生了高水平的中和抗体（2^4.3–2^4.6），淋巴细胞刺激指数显著升高，且外周血CD4⁺和CD8⁺ T细胞比例显著增加（p<0.0001）。攻毒保护试验中，10^3.5 TCID₅₀及以上剂量组对10²和10³ DLD₅₀强毒攻击均实现100%保护，而10^2.5 TCID₅₀低剂量组的保护率分别为80%和60%；所有未免疫对照鸭在攻毒后5–6天内死亡。病毒排毒监测显示，高剂量免疫组在攻毒后6天即停止排毒，而对照组持续排毒直至死亡。基因组分析发现，疫苗株相较于强毒株存在9个非同义突变、10个同义突变，以及UL43基因中的无义突变导致该蛋白提前终止。

图1 鸭肠炎病毒（DEV）感染鸡胚成纤维细胞（CEF）后的细胞病变效应（CPE） 

结论与意义

本研究成功开发了一种基于CEF细胞培养、以印度本地DEV强毒株为亲本的减毒活疫苗DPvac/IVRI-19。该疫苗被证实完全无毒力、遗传稳定不返毒，且单次皮下免疫即可诱导稳健的体液与细胞免疫应答，对致死性强毒攻击提供完全保护。相较于现有鸡胚适应疫苗，细胞培养疫苗具有成分纯净、易于标准化大规模生产、滴度稳定可控等优势，且因基于本地流行株，理论上与田间流行毒株的抗原匹配度更高，有望提供更有效的保护。该疫苗候选株在印度乃至全球鸭瘟防控中具有潜在的应用价值，但尚需进一步开展田间试验以验证其在实际生产条件下的安全性与有效性。

参考来源：Dandapat, S., Bindu, S., Sharma, G. K., Panickan, S., Nandi, S., Saikumar, G., & Dhama, K. (2024). Development and evaluation of a chicken embryo fibroblast cell culture based live attenuated Indian strain duck plague vaccine. Veterinary Quarterly, 44(1), 1–12. https://doi.org/10.1080/01652176.2024.2350668.