氢化可的松立大功！大黄鱼成肌细胞无血清培养基实现高效扩增分化

细胞培养肉是未来替代蛋白重要方向，大黄鱼作为我国高价值海水经济鱼类，细胞培养鱼肉产业发展受困于胎牛血清：血清成本高昂、批次差异大、组分不明确，极大限制大规模放大生产。目前哺乳动物肌肉细胞无血清培养基研究较多，但适合鱼类肌成肌细胞的无血清配方十分稀缺。浙江大学团队通过统计试验设计 + 转录组解析，开发一套组分简化的大黄鱼肌成肌细胞无血清培养基，为水产细胞培养肉的细胞大规模扩增提供技术参考。

研究设计：多因子筛选，配方逐步简化

研究从大黄鱼肌肉组织分离肌成肌细胞，选取11种潜在活性添加物，采用Plackett‑Burman、Box‑Behnken试验设计开展多因子筛选，再通过消除法删减冗余组分。基础培养基：DMEM/F12。最终简化配方：DMEM/F12 + 5 mg/mL BSA +20 mmol HEPES +1% 双抗+氢化可的松（唯一必需外源添加物）。设置含血清培养基（SM，10% FBS）作为对照组，27 ℃、5% CO₂条件培养；评价指标包含细胞活力、增殖倍数、群体倍增时间、肌管融合指数；转录组测序解析氢化可的松调控增殖的分子通路。

培养基筛选与配方确认

PB试验结果显示乙醇胺、孕酮、L‑肉碱、维生素E对细胞活力影响最大；但仅这4种因子组合培养效果显著弱于全部11种因子共同添加。后续逐一剔除组分验证，发现只有移除氢化可的松会造成细胞增殖明显停滞，其余10种因子均可删减，由此得到极简配方。BSA梯度试验确定5 mg/mL为最优使用浓度。

细胞增殖性能对比

培养第3天，无血清组（SFM）活细胞数量达到含血清对照组的65%；镜下细胞形态舒展，贴附状态良好。第2天、第3天的群体倍增时间、扩增倍数，SFM与SM两组没有统计学显著差异。EdU增殖染色：SFM组细胞可逐步适应无血清环境，增殖比例随培养时间上升；而含血清组增殖速率随培养时间推移逐步回落。细胞周期检测：SFM组 S+G2期细胞占比维持稳定，细胞持续处于增殖状态；去除氢化可的松的无血清体系，培养2天后增殖完全受阻，S期细胞占比大幅下降，细胞周期阻滞在G0/G1期，直接证实氢化可的松是维持细胞增殖的核心物质。

细胞干性与分化能力

免疫荧光与基因检测：SFM培养条件下，肌源标记Pax7、MyoD1持续高表达，证明成肌细胞的干细胞属性没有丢失。分化诱导后：SFM培养过的细胞能够形成数量更多的肌管，肌管融合指数显著高于含血清对照组。提示这套无血清扩增体系，不仅不损伤分化潜能，反而对后续肌管形成有正向作用。

转录组揭示作用通路

对比SFM与SM两组转录组，共得到1621个上调基因、1905个下调基因。1.氢化可的松结合G蛋白偶联受体，促使Gβγ亚基上调，激活下游PI3K‑AKT信号通路，促进细胞存活与增殖；2.无血清条件下TGF‑β/Smad通路显著激活，参与细胞骨架肌动蛋白聚合；3.黏着斑通路多个关键基因（ITGA、ITGB、Talin）上调，反映无血清环境下细胞通过上调黏附相关基因补偿环境缺陷。上述通路也指明后续配方迭代的潜在靶点。

参考文献：Zhang S,et al. An efficient serum‑free medium for ex vivo expansion of myoblasts from Larimichthys crocea for cultured meat production[J]. Food Research International,2024,196:115073. DOI:10.1016/j.foodres.2024.115073