纳米抗体PROTAC降解流感核蛋白实现跨亚型广谱保护

甲型流感病毒每年造成 300‑500 万例重症，死亡人数达 29 万‑65 万。除季节性流行的H1N1、H3N2亚型外，H5、H7、H9等禽源流感病毒不断突破物种屏障感染人类。其中H5、H7亚型累计人类感染病例超2600例，病死率超过40%。当前防控手段存在明显短板：疫苗受 HA 抗原漂移限制，毒株需要定期更新；奥司他韦、扎那米韦等传统抗病毒药物已经出现耐药毒株；即便新型药物巴洛沙韦、法匹拉韦，同样存在耐药发生的隐患。因此，研发靶向病毒保守蛋白、能够规避抗原变异干扰的广谱抗病毒手段，具有十分迫切的现实需求。蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）通过招募E3泛素连接酶使靶蛋白泛素化后被降解，与传统抑制剂占据活性位点的机制不同，只需结合靶蛋白即可促其降解。纳米抗体分子量小、稳定性高、组织穿透性好，适合构建PROTAC。流感病毒NP蛋白序列保守、表达丰度高（仅次于M1），是理想的广谱抗病毒靶点。

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所团队在《Signal Transduction and Targeted Therapy》上发表论文《A nanobody-based proteolysis-targeting chimera offers broad-spectrum protection against diverse influenza virus infections》，将NP特异性纳米抗体与VHL E3连接酶α结构域融合，构建Nb-PROTAC，系统评价其体外和体内抗流感效果。具体结果如下：

1、Nb-PROTAC构建与初步筛选：

选取Schmidt等报道的5种NP纳米抗体（Nb52、Nb77、Nb135、Nb170、Nb355），分别与VHL α结构域融合，构建VHL-Nb52、VHL-Nb77、VHL-Nb135、VHL-Nb170、VHL-Nb355。在293T细胞中共转染NP-eGFP和VHL-Nb后，VHL-Nb135和VHL-Nb170组的荧光强度显著低于对应Nb组。Western blot显示，VHL-Nb135和VHL-Nb170组NP相对丰度分别降至30.0%和26.2%，而其他三种VHL-Nb组NP水平仍在71%以上。值得注意的是，Nb135和Nb170在Schmidt研究中属于弱抑制剂，但转化为PROTAC后降解能力反而最强，说明抑制活性与降解效率并不一致。

2、广谱降解能力验证

通过免疫共沉淀检测VHL-Nb135和VHL-Nb170与16种HA亚型（H1-H16）NP的结合，两者均可与全部16种NP共沉淀。降解实验显示，VHL-Nb135和VHL-Nb170对16种亚型NP均有降解作用，其中对H1、H2、H5、H6等亚型降解幅度较大（NP相对丰度降至40%-60%），对H12、H16等降解幅度较小，但均显著低于对应Nb组。对照VHL-Nb-Spike对NP无降解作用。

3、 细胞水平抗病毒效果

在A549细胞中，VHL-Nb135和VHL-Nb170均显著降低H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H9N2五种病毒的滴度。VHL-Nb170在24、48、72小时各时间点的病毒滴度均低于VHL-Nb135，抑制效果更强。发现表明，将纳米抗体发展成PROTACs可以显著增强其对流感病毒的抗病毒活性。

4、 小鼠体内保护效果

VHL-Nb135和VHL-Nb170在A549细胞中表现出广谱抗病毒活性，但VHL-Nb170抑制流感病毒复制的效果优于VHL-Nb135。研究采用AAV-LungM3载体经气管给药模型，每只小鼠接受两次5×10^10 vg，间隔3天，共1×10^11 vg。三周后以5 MLD50的H1N1（PR8）或H5N1（SD012）攻毒。H1N1攻毒组中，mVHL-Nb170组鼻甲病毒载量降低99.94%，肺部降低94.51%；对照组10天内全部死亡，mVHL-Nb170组体重下降不到10%，10只小鼠中9只存活（90%）。H5N1攻毒组中，mVHL-Nb170组鼻甲病毒载量降低96.71%，肺部降低93.86%；对照组14天内全部死亡，mVHL-Nb170组无明显体重下降，10只中8只存活（80%）。针对NP降解的纳米抗体PROTAC技术有效抑制流感病毒体内复制，并保护至少80%的小鼠免受不同流感病毒亚型的致命感染。

5、 降解机制解析

通过免疫沉淀进行泛素化分析，结果显示VHL-Nb170显著增强NP的泛素化修饰。MG132和LY294002分别抑制蛋白酶体和自噬溶酶体途径，蛋白分析显示MG132处理未影响NP降解，而LY294002处理则显著抑制NP降解。在ATG5敲除的293T细胞中，VHL-Nb170介导的NP降解完全消失，证实降解依赖自噬-溶酶体途径。免疫共沉淀筛选四种自噬受体（p62、OPTN、NDP52、TOLLIP），发现泛素化NP仅与OPTN特异性结合，说明VHL-Nb170介导的NP泛素化通过受体OPTN介导的自噬溶酶体途径被降解。

总结：该研究将纳米抗体转化为PROTAC，实现了对流感病毒NP蛋白的广谱降解。VHL-Nb170可降解全部16种HA亚型NP，在细胞中抑制人源和禽源流感病毒复制，在小鼠中经AAV-LungM3递送后对致死性H1N1和H5N1感染提供至少80%保护。机制上，泛素化NP经OPTN介导的自噬-溶酶体途径降解，不同于VHL介导的经典蛋白酶体途径，提示降解途径取决于靶蛋白自身特性。

文献连接： Zhuang Y, Chen L, Qin C, et al. A nanobody-based proteolysis-targeting chimera offers broad-spectrum protection against diverse influenza virus infections[J]. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2026, 11(1): 182.10.1038/s41392-026-02666-9