双转录因子共同激活疏水蛋白基因的表达调控金针菇子实体形态

疏水蛋白凭借其自组装特性及独特的结构和理化特征，在真菌的生长发育中发挥多种作用，尤其在大型真菌中，已被证实参与菌丝生长、原基分化和子实体发育等重要生物学过程。金针菇是世界上受欢迎的工厂化栽培大型真菌之一，也被认为是研究大型真菌子实体组织形态发生的潜在优良模式真菌。在工厂栽培过程中，金针菇的产量和质量很大程度上取决于原基数量和子实体菌柄长度。目前其疏水蛋白基因家族的系统研究及转录调控机制尚未明确。

山西农业大学刘靖宇团队在国际生物大分子期刊（IF:Q1,7.7）发表《Transcription factors FfMYB9 and FfMYB13 jointly activate the expression of hydrophobin gene FfHyd19 to mediate fruiting body morphogemesis in Flammulina filiformis》相关研究，揭示了 FfMYB9 和 FfMYB13 通过激活 FfHyd19 表达调控金针菇发育的分子机制，为食用菌育种提供理论基础。

1.  金针菇疏水蛋白基因家族（FfHyd）的鉴定与特征

全基因组分析鉴定出 19 个 FfHyd 基因（FfHyd1-19），不均匀分布于 6 条染色体（Chr1、3、5、6、7、11），其中 Chr1 数量最多，Chr7 最少。

氨基酸数量：105-143 个；分子量：10.4-14.72 kDa；等电点（pI）：3.28-8.92。均含信号肽，多数为酸性、亲水性蛋白，定位于细胞外。17 个为 I 类疏水蛋白（含特征性半胱氨酸 motif），2 个（FfHyd3、FfHyd9）为中间类型。与 双孢蘑菇（Agaricus bisporus）和平菇（Pleurotus ostreatus）的疏水蛋白亲缘关系较近，与香菇（Lentinula edodes）较远。

图 1. 全基因组定位与系统发育树构建。（A）FfHyd 基因家族的染色体定位。（B）金针菇中疏水蛋白（Hyd）的系统发育关系（红色星号标注）。

2.  FfHyd 基因的表达模式与功能验证

多数 FfHyd 基因在菌丝、原基、幼嫩子实体和成熟子实体中均有表达，但表达水平存在差异。FfHyd19在原基阶段表达显著高于其他阶段，提示其可能参与原基形成。

图 2.金针菇中疏水蛋白基因的表达谱。

（A）基于转录组分析得到的 FPKM 值绘制的疏水蛋白基因表达谱热图。（B）通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）验证疏水蛋白基因的表达模式，My 代表菌丝体，Pr 代表原基，YF 代表幼嫩子实体，MF 代表成熟子实体。每个数值表示平均值 ± 标准误（n=3）。柱形图上方不同的字母表示组间数据存在显著差异（P<0.05）。

通过对基因过表达（OE）处理，菌丝生长速率提高 3.7%-6.5%，原基形成提前 1 天，且数量增加，菌柄长度平均增加 2-2.4 cm。对基因RNA干扰处理后菌丝生长速率降低 8.4%-12.01%，原基形成延迟，且数量减少，菌柄长度显著缩短。

图 3. 过表达（OE）和 RNA 干扰（RNAi）菌株的验证。

（A）过表达和 RNA 干扰载体构建策略的示意图。（B）野生型（WT）、突变菌株及质粒对照中潮霉素抗性基因（hyg）的 PCR 验证。（C）通过 qPCR 对不同菌株中 FfHyd19 的表达水平进行定量分析。不同字母表示样本间比较存在显著差异（根据邓肯检验，p<0.05）。

图 4. FfHyd19 正向调控营养生长。

（A）不同菌株在 CYM 培养基上的菌落形态及垂直显微镜下的菌丝形态，沿红色箭头指示方向观察菌丝边缘。标尺 = 100μm（B）不同菌株在 CYM 培养基上的菌丝生长速率，不同字母表示样本间比较存在显著差异（根据邓肯检验，p<0.05）（C）不同菌株的菌丝在培养瓶中 11 天的生长情况。

图 5. FfHyd19 促进金针菇子实体生长。

（A）野生型菌株和 FfHyd19 突变菌株从菌丝扭结到子实体发育的结果。（B）平均子实体数量和平均菌柄高度。不同字母表示根据邓肯检验，样本间比较存在显著差异（p<0.05）。

3.  FfHyd19 的转录调控机制

FfHyd19 启动子含 MYB 结合位点（MYB结构域是一段约51-52个氨基酸的肽段，包含一系列高度保守的氨基酸残基和间隔序列），提示可能受 MYB 转录因子调控。FfMYB9 和 FfMYB13 的功能：表达模式与 FfHyd19 一致，在原基和子实体阶段高表达。亚细胞定位显示：定位于细胞核，为转录激活因子。通过 凝胶迁移实验（EMSA） 和双荧光素酶报告实验证实，二者可直接结合 FfHyd19 启动子的 MYB 元件并激活其表达。

图 6. FfMYB9 和 FfMYB13 的亚细胞定位及转录活性分析。

（A）亚细胞定位分析。荧光显微镜图像显示，在浸润后 60 小时，烟草叶表皮细胞中 EGFP（阳性对照）、FfMYB9-EGFP 和 FfMYB13-EGFP 融合蛋白的表达情况。标尺 = 25μm。（B）双荧光素酶报告基因实验中所用的效应子和报告基因构建体的示意图。（C）FfMYB9 和 FfMYB13 的转录激活分析。空 pBD 载体的萤火虫荧光素酶（Luc）与海肾荧光素酶（Ren）的比值被标准化为 1，作为基线对照。数据以 6 次独立生物学重复的平均值 ± 标准误（SEM）表示（n=6）。星号表示与对照组相比具有统计学显著差异（*p<0.05，**p<0.01）。

结论：

该研究揭示了金针菇子实体形态发生的分子机制，为大型真菌疏水蛋白基因的功能研究和转录调控机制探索提供新见解，不仅深化了对大型真菌发育生物学基础理论的理解，更为金针菇等具有重要经济价值的大型真菌商业品种的定向育种和品质改良提供了坚实的理论基础和实践指导，特别是在子实体形态优化、产量提升等应用领域具有重要指导意义。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2025.145611