Communications Biology：南京农业大学赵明文教授团队灵芝耐热性方面的最新研究进展

给大家分享南京农业大学赵明文教授团队的最新研究进展，关于糖原合酶激酶3磷酸化激活海藻糖-6-磷酸合酶促进海藻糖生物合成增强灵芝耐热性。针对这一课题，该团队的陈虎辉副教授在国际著名期刊Communications Biology《通讯-生物》杂志上发表了相关论文，题为“GSK3 phosphorylates and activates trehalose-6-phosphate synthase to improve trehalose production and thermotolerance in Ganoderma lucidum”。

灵芝作为著名的食药用真菌，富含多种药理成分，具有广泛的治疗和健康促进特性。随着其基因组测序完成和基因编辑技术的进步，灵芝已成为研究担子菌生长、发育和次生代谢调控的潜在模式系统。在自然环境中，高温是真菌生长的主要非生物限制因素。热胁迫严重降低酿酒酵母的存活率，抑制禾谷镰刀菌的菌丝生长，并减少平菇的生物量生产。同样，灵芝的菌丝生长在高温下也会受到抑制。近年来，全球气候变暖趋势加剧，极端高温事件的发生频率与强度逐年攀升。这种气候格局下，热胁迫对食用菌产业的冲击愈发强烈，如何应对这一挑战已成为当前农业科学领域的迫切课题。

糖原合酶激酶3（Glycogen synthase kinase 3，GSK3）作为真核生物中高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，深度参与调控生物体的多种生长发育过程。与动植物中GSK3的研究相比，其在丝状真菌中的功能研究较少，尤其是潜在的分子机制。

海藻糖是一种广泛存在于生物体内的非还原性二糖，通过维持细胞膜稳定性和结构完整性在胁迫响应中发挥保护作用。海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS）是海藻糖生物合成的关键酶酶，在真菌发育和胁迫耐受中起重要作用。研究表明，冷、热、干旱等多种胁迫可诱导真菌中海藻糖的积累，其中热胁迫显著增加金针菇、平菇和酿酒酵母的海藻糖水平。尽管现有研究主要集中在TPS在海藻糖生物合成和胁迫适应中的作用，但其翻译后修饰机制仍不清楚。

一、GlGSK3影响灵芝菌丝生长及子实体发育。

作者鉴定出灵芝中的GSK3，并构建了其敲低菌株，以探究其对灵芝生长发育的影响。结果表明glgsk3的敲低不仅损害了灵芝菌丝的生长，还抑制了其子实体的发育，

二、GlGSK3与GlTPS相互作用。

为研究GlGSK3调控灵芝生理过程的机制，以GlGSK3为诱饵对灵芝cDNA文库进行酵母双杂交文库筛选，寻找其相互作用蛋白。在筛库结果中，基于TPS同源物在介导真菌生长和胁迫响应中的报道作用，选择GlTPS进行进一步分析。酵母双杂交、双分子荧光、GST pulldown和Co-IP实验进一步验证了GlGSK3与GlTPS的相互作用。

三、GlGSK3在Ser529位磷酸化GlTPS以增强其酶活性。

作为蛋白激酶，GSK3通常通过磷酸化底物蛋白发挥生物学。为此作者探究了GlTPS是否为GlGSK3的磷酸化底物。体外磷酸化实验及内源磷酸化水平测定结果表明，GlGSK3特异性磷酸化GlTPS并增强其酶活性。LC-MS结合定点突变试验发现，GlTPS的丝氨酸529（S529）位点是GlGSK3修饰的唯一残基，该位点的模拟持续磷酸化突变显著增强其酶活性。

四、GlTPS影响灵芝海藻糖合成和菌丝生长。

为探究GlTPS在灵芝中的生物学功能，作者构建了gltps的敲低菌株。进一步的测定发现，gltps表达水平的降低显著抑制了灵芝菌丝的生长，且gltps和glgsk3敲低菌株的TPS酶活性及海藻糖含量相较于WT菌株均显著降低。

五、GlGSK3-GlTPS模块调控灵芝热胁迫抗性。

鉴于GSK3和TPS在非生物胁迫响应中的已知作用，作者研究了GlGSK3-GlTPS模块在高温耐受性中的作用（高温是限制灵芝生长的主要因素）。探究发现，热胁迫诱导GlGSK3和GlTPS在mRNA和蛋白水平的表达。相应地，WT菌株中GlTPS的磷酸化水平在热胁迫下增加，而glgsk3-kd菌株中该效应减弱，表明GlGSK3活性是热胁迫诱导的GlTPS磷酸化所必需的。进一步测定发现，热胁迫增强所有菌株的TPS酶活性，但glgsk3-kd和gltps-kd菌株中的诱导显著减弱，且敲低菌株中热诱导的海藻糖积累也相应减少。平板生长实验表明，热胁迫下glgsk3-kd和gltps-kd菌株比WT菌株表现出更大的生长抑制，表明耐热性受损。外源添加海藻糖减轻所有菌株的热胁迫抑制，且敲低菌株中海藻糖的恢复效果显著高于WT菌株，暗示其内在海藻糖生物合成受损。这些结果表明，GlGSK3-GlTPS模块对灵芝的耐热性至关重要。

该研究鉴定了对灵芝发育和耐热性至关重要的GlGSK3-GlTPS信号轴，证明GlGSK3介导的GlTPS在S529位的磷酸化作为关键的翻译后开关，快速增强海藻糖生物合成以赋予热胁迫保护。基于这些发现，提出GlGSK3在平衡生长和胁迫响应中的双重作用模型：在最佳条件下，GlGSK3活性促进糖酵解通量（可能通过磷酸化糖原合成酶抑制糖原合成），以支持丙酮酸和ATP生产，从而促进正常生长和发育；热胁迫下，GlGSK3和GlTPS表达的协同上调导致GlTPS磷酸化和激活增强，将碳代谢重定向至海藻糖积累，这对不利环境条件下的存活至关重要。这一机制说明了一种复杂的代谢适应，其中保守激酶通过不同底物整合营养状态和胁迫响应。