西北师范大学生命科学学院朱学泰团队的这项发现或为羊肚菌种植产业的真菌病害防治提供新思路?

本期论文介绍

羊肚菌红脚病严重制约了羊肚菌，特别是六妹羊肚菌（Morchella sextelata）的大规模栽培，但目前缺乏有效且环境友好的防治策略。

西北师范大学生命科学学院朱学泰团队的这项研究首次揭示了一种全新的红脚病发病机制：其致病菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）M-5和绿针假单胞菌致金色亚种（Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens）M-B产生的挥发性有机化合物。

研究也鉴定了这些挥发性有机化合物中具有抗真菌活性的关键化合物，分别为2,3-丁二酮和2-甲基丙酸。这两种化合物通过严重破坏菌丝膜完整性、诱导细胞内容物泄漏、破坏氧化还原稳态等机制产生抗真菌作用。本研究的发现扭转了羊肚菌红脚病中细菌-真菌互作的传统观点，并证明病原菌产生的挥发性物质在红脚病发病过程中起着关键作用。因此，本研究为优化大棚种植通风管理、消除有害的挥发性有机化合物提供了最直接的理论基础。这对于开发新型绿色防控策略、实现羊肚菌可持续高产栽培至关重要。

本文发表于ASM期刊Microbiology Spectrum。

关键词      #枯草芽孢杆菌，#绿针假单胞菌，#抗真菌机制，#膜完整性，#氧化应激

羊肚菌含有多种稀有氨基酸和丰富的挥发性香气成分，长期以来被视为美食佳肴中的珍品。近年来的研究表明，羊肚菌多糖具有免疫调节、抗肿瘤和抗氧化作用，使羊肚菌成为功能性食品领域的优先开发品类。

自2010年成功实现商业化栽培以来，我国羊肚菌的产量大幅增长。然而，在羊肚菌产业发展中存在一个关键瓶颈问题：红脚病反复爆发，常常导致羊肚菌的产量大幅下降，严重时甚至绝收。在发病初期，已形成的羊肚菌子实体从菌柄处出现红褐色，随后颜色逐渐加深，并从基部向上蔓延。最后整个子实体发红，散发出恶臭味。随着病害发展，羊肚菌逐渐失去活力，生长停滞，最终腐烂，且不再产生新的子实体。红脚病可在田间迅速传播，摧毁整个种植区。既往研究表明，土传细菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和绿针假单胞菌致金色亚种（Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens）是红脚病的主要病原菌，随后的致病机制实验表明病原菌定殖是羊肚菌发病原因。

在本研究的初步双层平板实验中，即使在羊肚菌菌丝块3 cm以外的位置接种病原菌，六妹羊肚菌径向生长仍受到显著抑制。该结果表明，病原菌释放的挥发性有机化合物介导了羊肚菌的生长抑制效应。这也解释了在红脚病爆发期间，羊肚菌停止产生新的子实体，而现有子实体变红并腐烂的原因：即使不直接与病原菌发生物理接触，菌丝生长也会被病原菌释放的挥发性有机化合物所抑制。该结果与细菌挥发性有机化合物已知对多种真菌病原体的抑制作用一致。例如，Massawe等人报道，芽孢杆菌属（Bacillus spp.）产生的8种挥发性有机化合物能有效抑制核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）的菌核形成和菌丝延伸。同样，短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）和苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）所产生的挥发性有机化合物能显著限制胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）的体外菌落扩增。在机制层面，这类挥发性物质可直接破坏真菌细胞壁和细胞膜的完整性，诱导细胞内容物泄漏；其中以枯草芽孢杆菌CL2产生的2,3-丁二酮为代表，它能破坏黄曲霉（Aspergillus flavus）的细胞膜。此外，挥发性有机化合物还能诱导活性氧（ROS）大量生成，打破细胞氧化还原稳态，最终诱导细胞凋亡或死亡。例如，由绿针假单胞菌致金色亚种SPS-41产生的挥发性有机化合物能诱导甘薯长喙壳菌（Ceratocystis fimbriata）中活性氧蓄积、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性异常升高，从而抑制菌丝生长。寡养单胞菌属（Stenotrophomonas sp.）细菌NAU1697的挥发性有机化合物可显著抑制黄瓜尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）的菌丝延伸和孢子萌发，其中以2-乙基己醇的活性最高，接种细菌后可见真菌菌丝细胞膜完整性受损，麦角固醇水平下降，活性氧大量生成。

鉴于枯草芽孢杆菌和绿针假单胞菌金黄亚种通过挥发性物质对六妹羊肚菌产生抑制作用的机制尚未得到系统阐明，我们设计了本研究：

验证这些病原菌释放的挥发性有机化合物对六妹羊肚菌菌丝生长的抑制效应

通过GC-MS表征挥发性物质的组成，并通过外源性补充实验鉴定生物活性成分

通过评估菌丝膜完整性、胞内活性氧蓄积和关键抗氧化酶活性探索这些挥发性物质产生抑制效应的分子机制。

图1（A和B）M-5和M-B两种病原菌产生的挥发性有机化合物对六妹羊肚菌菌丝生长的抑制效应

本研究系统解析了细菌挥发性有机化合物在抑制六妹羊肚菌菌丝生长中的功能作用，为开发新型的红脚病生物防治策略提供了理论基础，同时也填补了羊肚菌属真菌-细菌相互作用方面的关键知识空白。

论文信息

论文标题：

Volatile organic compounds associated with red-stripe pathogens inhibit mycelial growth of Morchella sextelata by disrupting membrane integrity and inducing oxidative stress

关键词：

Bacillus subtilis, Pseudomonas chlororaphis, antifungal mechanism, membrane integrity, oxidative stress

作者：

Xuetai Zhu, Yongxiang Dang, Qi Yang, Yaqin Zeng, Fei Su

机构：

西北师范大学生命科学学院

摘要

羊肚菌红脚病是由细菌引起的毁灭性病害，严重威胁六妹羊肚菌（Morchella sextelata）的商业化栽培。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）M-5和绿针假单胞菌致金色亚种（Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens）M-B是羊肚菌红脚病的主要致病菌。本研究发现，这些病原菌产生的挥发性有机化合物（VOC）能完全抑制六妹羊肚菌的菌丝生长，扫描电子显微镜检查可见菌丝严重萎缩塌陷。采用顶空气相色谱离子迁移谱法鉴定了由枯草芽孢杆菌M-B和绿针假单胞菌M-5产生的具有抗真菌活性的主要挥发性有机化合物，分别为2,3-丁二酮和2-甲基丙酸。外源性补充实验证实，这两种化合物具有强大的真菌抑制活性，最低抑制浓度（MIC）分别为150 µL/mL和250 µL/mL。机制研究表明，2,3-丁二酮和2-甲基丙酸这类挥发性有机化合物可破坏细胞膜的完整性，促使胞内核酸和蛋白质大量泄漏，诱导脂质过氧化，并激活抗氧化防御反应，导致超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性升高。本研究揭示，细菌产生的挥发性有机化合物是导致红脚病生长停滞的挥发性致病物质，这为开发羊肚菌红脚病新型防治策略提供了重要的理论依据。