细菌复杂性的高分辨解码：单细胞转录组学

研究背景

细菌群体中普遍存在着细胞间的表型异质性，这种差异性被认为是细菌在抗生素暴露或营养波动等恶劣环境中生存的重要“两头下注（bet-hedging）”策略，同时也促进了群落内的劳动分工。近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）在真核生物中掀起了研究革命，但由于细菌mRNA丰度极低（每个细胞内仅数十到数百个分子）、半衰期极短、缺乏用于富集的poly(A)尾，且面临复杂的细胞壁结构挑战，细菌的单细胞测序发展一直严重滞后。该文系统综述了近期克服这些技术瓶颈的突破性进展，展示了该技术如何将我们对细菌生理学、耐药性演化以及复杂群落动态的理解推向极高分辨率的新纪元。

主要内容

细菌scRNA-seq的技术突破与核心发现

①跨越技术鸿沟的发展演进（图1）

梳理了单细胞转录组学从真核向原核生物演进的时间线，标志着微生物学正式从掩盖亚群差异的“大部分（Bulk）”群体平均分析时代，跨入精准识别罕见细胞状态的单细胞时代。

图1 真核生物与原核生物单细胞转录组学方法的发展时间线。

 细菌和真核生物的单细胞转录组学方法分别显示在时间线的下方和上方。 用于捕获和分析单细胞转录程序的技术框架按颜色指示：灰色，基于细胞大小选择的微流控芯片；紫色，FACS；红色，基于液滴包裹的微流控芯片；蓝色，基于孔板的分池条形码；黄色，空间转录组学方法。 Smart-seq，RNA模板5'端测序的切换机制；Smart-seq2，一种通常与FACS结合使用的更灵敏、经过优化的Smart-seq版本；sci-RNA-seq，单细胞组合索引RNA测序；SPLIT-seq，基于分池连接的转录组测序。

②多维度的单细胞转录组建库工作流（图2）

全面总结了目前主流的四种实验工作流：包括传统的荧光激活细胞分选（FACS）、新兴的液滴包裹和孔板分池条形码测序，以及基于物种特异性探针的原位杂交成像，极大扩展了研究工具箱。

图2 细菌单细胞转录组学方法。

a-d, 可以通过以下方式捕获并对单个细菌细胞的转录组进行测序分析：FACS (MATQ-seq) (a)、基于孔板的分池条形码 (PETRI-seq、microSPLIT和BaSSSh-seq) (b)、微流控液滴包裹 (BacDrop、M3-seq和smRandom-seq) (c) 或通过利用针对感兴趣生物体的杂交探针构建文库进行测序 (ProBac-seq) (d)。e, f, 另外，空间转录组学方法依赖于成像来分析针对感兴趣生物体的探针集的原位杂交模式，保留单个细胞中基因表达的空间和亚细胞结构。e, par-seqFISH使用迭代轮次的原位杂交和成像，随后进行剥离和重新探测。f, Bacterial-MERFISH依赖于对单个细菌细胞进行物理膨胀，然后进行探针杂交，并通过成像对探针条形码模式进行枚举。RT，逆转录。

③高效富集mRNA的去核糖体策略（图3）

针对细菌总RNA中高达80-95%为无用核糖体RNA（rRNA）的难题，研究总结了多种提高mRNA捕获率的创新酶学与生化方法，包括使用RNase H酶解rRNA靶标、利用CRISPR-Cas9系统进行靶向切割，以及生物素探针扣除杂交等，将信使RNA的测序占比显著提升。

图3 rRNA去除和mRNA富集策略。

a, b, rRNA或衍生自rRNA的cDNA可以使用RNase H从样本或文库中去除，方法是在捕获mRNA靶标之前在原位透化细胞中消化rRNA (BacDrop) (a)，或在构建文库后，通过增加T7体外转录步骤并随后用RNase H消化rRNA-DNA杂交体 (M3-seq) ，最后再进行最终的文库构建 (b)。c, d, 或者，可以使用CRISPR-Cas9和靶向rRNA的单向导RNA来切割衍生自rRNA的cDNA (MATQ-seq和smRandom-seq) (c) 或最终的文库序列 (PETRI-seq) (d)。e, 最后，可以通过扣除杂交来去除衍生自rRNA的cDNA物质，该方法使用生物素化的rRNA探针，这些探针在与衍生自rRNA的cDNA杂交后，使用磁性链霉亲和素磁珠将其与样品的其余部分分离（BaSSSh-seq和衍生自核糖体RNA的cDNA去除PETRI-seq (RiboD-PETRI)）。f, 作为rRNA去除的替代方法，可以在靶标捕获期间富集mRNA物质，方法是首先使用PAP在原位透化细菌细胞中选择性地对mRNA进行多聚腺苷酸化，然后在逆转录过程中使用oligo(dT)和随机六聚体进行引物结合 (microSPLIT)。 ssDNA，单链DNA。

④针对超稀疏数据的降维与机器学分析（图4）

确立了细菌scRNA-seq的计算分析规范。面对极度稀疏的数据集，通过应用深度生成模型（如scVI）进行数据去噪和批次校正。这种先进的聚类分析成功揭示了被掩盖的微小亚群，例如在抗生素美罗培南处理下，发现了过度表达cspD毒素从而产生耐药持留特性的亚群，以及受可移动遗传元件（MGEs）驱动的异质性。

图4 细菌scRNA-seq的计算分析流程。

a, 数据首先经历预处理，其中测序读段被修剪、质量过滤，并比对到参考基因组或宏基因组基因目录。 质量指标用于评估数据质量、估计条形码碰撞率并过滤细胞，以从通过定义的质量指标的高质量细胞生成数字基因表达矩阵。 然后对基因表达矩阵进行插补、缩放和对数转换。b, 然后通过将这些高维基因表达数据嵌入到较低维度的空间中进行分析，在该空间中对其进行去噪、批次校正，并最终聚类为细胞类型和细胞状态。c, 以细胞为中心的聚类可以揭示新的细胞类型或细胞状态，而差异丰度测试可以揭示这些群体或其基因表达水平中与条件相关的变化，从而促成生物学发现。 针对其调控网络的以基因为中心的分析也可以揭示细菌转录回路。d, 计算分析的未来方向可能包括细胞谱系的推断、新基因功能的发现以及利用细胞条形码解析菌株基因组。