同义突变并不“沉默”：研究发现改变RNA结构就能显著削弱病毒

我们习惯把病毒基因组理解成一串“编码蛋白质的信息”：核苷酸决定密码子，密码子决定氨基酸，最终形成病毒蛋白。但如果同一段RNA在不改变蛋白质序列的情况下，仅仅改变折叠方式，就能让病毒复制能力下降近100倍，甚至显著降低致病性，这意味着什么？

近日，《Cell》的研究报道“RNA structures regulate norovirus life cycle and enable rational attenuation in vivo”，研究人员以鼠诺如病毒（murine norovirus, MNV）为模型发现：病毒RNA不仅负责“编码”，其自身形成的二级结构（RNA secondary structure）还是病毒复制和翻译的重要调控层。更进一步，他们尝试直接改变这些结构，在不大幅改变病毒蛋白组成的情况下将病毒“调弱”，为RNA病毒的理性减毒（rational attenuation）提供了一条新的思路。

一条只有7.4 kb的病毒RNA，为什么要花这么大力气研究它怎么“折”？

鼠诺如病毒是一种正链单链RNA病毒（positive-sense single-stranded RNA virus），整个基因组只有大约7.4 kb。

从信息密度来看，它已经相当“拥挤”。

病毒基因组几乎全部用于编码蛋白，5′非翻译区（5′ untranslated region, 5′ UTR）只有5个核苷酸，3′ UTR也只有78个核苷酸。负责产生病毒衣壳蛋白VP1和VP2的亚基因组RNA（subgenomic RNA, sgRNA）长度约2.4 kb，其5′ UTR甚至只有4个核苷酸。

当“不编码蛋白”的空间如此有限时，一个很自然的问题出现了：

病毒还把复制、翻译时机以及不同蛋白之间的表达比例等调控信息放在哪里？

答案可能就隐藏在编码区本身。

RNA并不是一根伸展开来的线。不同位置的核苷酸可以彼此配对，形成茎环、发夹以及更加复杂的多分支结构。换句话说，同一条RNA同时包含两类信息：一类来自核苷酸顺序，也就是我们熟悉的序列信息；另一类来自这些核苷酸在空间上如何折叠。

研究人员因此没有首先去问“哪个基因最重要”，而是换了一个问题：

病毒RNA在感染细胞里究竟折叠成什么样？

他们使用两种相互独立的细胞内RNA化学探测方法——SHAPE突变谱分析（SHAPE-MaP）和四碱基DMS突变谱分析（four-base DMS mutational profiling, fbDMS-MaP），直接研究感染细胞中的病毒RNA。

结果显示：

整个MNV基因组中，接近57%的核苷酸参与碱基配对。

作为参照，随机RNA序列中这一比例大约只有30%。

研究人员进一步结合SHAPE反应性和Shannon熵（Shannon entropy），筛选出同时具有较低结构柔性和较稳定折叠状态的区域，共识别出16个静态结构区域（static structural regions）。

这些区域的平均碱基配对比例进一步升高到66.5%。

而且，它们并非均匀分布。

编码结构蛋白VP1和VP2的区域最为突出，大约60%的RNA位于这些高度稳定结构区域；NS1/2和VPg约为40%，NS4约10%，RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp）约27%，NS3和蛋白酶区域则没有发现符合标准的静态结构区域。

这已经提示：RNA结构很可能并非病毒复制过程中偶然形成的副产品。

它们有自己的“地理分布”.

如果这些结构没有用，进化为什么要费力把它们保留下来？

看到稳定结构，并不等于证明它有功能。

RNA自然会折叠。一段RNA形成发夹，也可能只是一种物理结果。

因此，研究人员寻找了第二条证据：进化选择压力。

这里最值得关注的是同义突变（synonymous mutation）。

同义突变改变了RNA序列，却不改变蛋白质的氨基酸序列。如果某段RNA只承担蛋白质编码功能，那么很多同义突变原则上具有较大的变化空间。

但如果一段RNA还必须保持特定折叠方式，那么即便氨基酸不变，有些同义突变也不能随意发生——因为它可能破坏碱基配对。

研究人员比较了RNA双链区域和单链区域的同义突变率（synonymous substitution rate, dS）。

结果发现，双链区域的dS显著更低。

而非同义突变率（non-synonymous substitution rate, dN）在单链和双链区域之间没有表现出同样的差异。

这个结果的重要之处在于，它把“RNA形成稳定结构”与“这些结构受到进化选择”联系了起来。

而且这种模式不仅存在于单一MNV毒株中。

研究人员进一步比较了来自9个诺如病毒基因群（GI–GIX）的序列，仍然观察到双链区域同义突变受到更强限制。再把鼠诺如病毒与人诺如病毒GII型（human norovirus genogroup II, HNV GII）比较时，基因组两端、RdRp-VP1交界区域以及VP1内部都出现了相似的同义突变受限区域。

这并不能直接证明鼠病毒中的每一个RNA结构在人诺如病毒中都具有相同功能。

但它提出了一个相当值得追踪的可能性：

病毒在进化过程中保存的，也许不只是蛋白质序列，还有RNA必须维持的“形状”。

从“看见结构”到“证明结构有用”，中间差的是一整条因果证据链

一项RNA结构研究最容易停留在“画出很多漂亮的茎环”。

这项工作的关键之处，是继续关注：如果主动把这些结构拆开，病毒会发生什么？

研究人员首先使用锁核酸（locked nucleic acid, LNA）与目标RNA区域结合，希望扰乱原有局部结构。

结果显示，与对照相比，针对候选结构区域的LNA处理可以让感染后的细胞存活率提高约15%–35%；在病毒噬斑实验（plaque assay）中，部分结构靶向LNA使病毒滴度下降最多约1个log数量级，也就是接近10倍。

用于验证体系有效性的阳性对照LNA甚至可以使病毒滴度下降约1.5 log。

但这里出现了一个很有意思的例外：lowSS10。

LNA靶向lowSS10时，没有观察到明显的病毒生长缺陷。

如果实验停在这里，很容易得出“lowSS10可能不重要”的结论。

研究人员没有这样处理。

他们考虑到，LNA能否发挥作用还取决于RNA区域是否容易接近、是否被蛋白质占据，以及sgRNA的丰度是否高到足以“稀释”LNA的结合效果。

于是，他们直接修改病毒基因组。

研究人员在lowSS1、lowSS5、lowSS6、lowSS10和lowSS13等区域引入一系列同义突变：尽量保持编码的氨基酸不变，却破坏原有碱基配对，使RNA结构被“解开”。

这一步让lowSS10的作用显现出来了。

一个结构让翻译加速，另一个结构却在主动“踩刹车”

在细胞培养中，lowSS1结构破坏后，病毒早期滴度最多下降约1个log；lowSS5、lowSS6和lowSS13的影响相对温和，早期大约下降0.5 log。

lowSS10则表现得最明显。

在感染后24小时和48小时附近，lowSS10结构破坏突变体的病毒滴度相比野生型下降接近2个log数量级，也就是接近100倍。

但这里仍然存在一个关键问题：

究竟是RNA结构被破坏导致病毒复制下降，还是这些核苷酸变化本身带来了其他影响？

研究人员设计了“补偿突变”（compensatory mutation）。

他们再次改变RNA序列，但把原先被破坏的碱基配对重新建立起来。

结果，病毒滴度恢复到接近野生型水平。

研究人员还采用不同的同义密码子构建lowSS10突变体，依然得到相似的复制缺陷。

因此，至少在这些实验条件下，证据更支持一个因果解释：

决定表型的关键不是某几个特定核苷酸，也不仅仅是密码子使用，而是这些核苷酸能否形成特定RNA结构。

接下来的翻译报告实验（translation reporter assay）又揭示了一个更有意思的现象。

lowSS1和lowSS10都位于RNA的翻译起始端附近，但功能方向恰好相反。

破坏lowSS1后，报告基因的翻译量下降，说明lowSS1更像一个顺式翻译增强元件（cis-acting translational enhancer）。

破坏lowSS10后，翻译量反而上升，说明lowSS10是一种顺式翻译抑制元件（cis-acting translational repressor）。

为什么病毒要主动抑制自己的蛋白质翻译？

lowSS10位于sgRNA起始区域。结构模型显示，它把翻译起始密码子AUG包裹在配对形成的茎结构之中，从而降低核糖体对AUG的可及性。

这意味着病毒可能并不是一味追求“蛋白质越多越好”。

对于高度丰富的sgRNA，如果衣壳蛋白过早或过量产生，而可供包装的病毒基因组不足，就可能形成更多不能有效传播的颗粒。

因此，病毒需要解决的并不是最大化表达，而可能是控制表达的比例和时机。

这一点值得注意：在复杂生物系统里，“抑制”并不天然意味着功能下降。有时候，限制一个过程恰恰是维持整体效率的一部分。

把一个RNA结构拆开后，病毒在小鼠体内明显“弱”了

细胞实验仍然不能回答最关键的问题：这些结构会不会影响一个完整宿主体内的感染过程？

研究人员随后使用C57BL/6小鼠进行感染。

感染4天后，他们检测肠系膜淋巴结（mesenteric lymph node, MLN）、回肠、结肠和脾脏中的病毒RNA。

lowSS10仍然是表现最突出的突变体。

在肠系膜淋巴结中，lowSS10突变体的病毒RNA水平比野生型低接近2个log；lowSS1大约下降1个log，而lowSS5、lowSS6和lowSS13的下降幅度约为0.5 log。

在回肠中，lowSS10的病毒RNA已经大部分检测不到。

在结肠和脾脏中，同样检测不到lowSS10病毒RNA。

研究人员随后把实验推进到免疫功能受损的IFNAR敲除小鼠（IFNAR knockout mice）。这类小鼠对MNV CW3感染高度敏感。

感染lowSS10突变病毒后，小鼠没有出现体重下降，10只小鼠中有9只存活到实验观察结束。

这里还有一个需要特别说明的技术细节。

lowSS10的突变虽然在VP1编码框架中属于同义突变，但由于该区域与另一个开放阅读框VF1重叠，因此会改变VF1蛋白。

为了避免把VF1改变误认为RNA结构效应，研究人员额外构建了VF1敲除病毒进行对照。

结果仍然支持：观察到的减毒表型主要来自RNA结构破坏，而不是VF1蛋白变化。

这类控制实验看似只是技术细节，却决定了“相关性”能否进一步走向“因果性”。

最有意思的一步：不大幅改变病毒蛋白，能不能直接把病毒设计成减毒状态？

到这里，这项研究已经回答了RNA结构是否重要的问题。

但研究人员又向前走了一步：

既然破坏lowSS10能够明显降低病毒复制和致病性，那么这种病毒能否保留足够的免疫原性（immunogenicity），成为一种结构指导的减毒策略？

他们先用lowSS10突变病毒感染正常小鼠。

两周后，再用野生型MNV CW3进行攻击。

lowSS10感染能够诱导抗MNV免疫球蛋白G（immunoglobulin G, IgG）反应。到初次感染两周后，lowSS10组和野生型组都已经形成较强的抗体反应。

更关键的是二次攻击后的病毒控制能力。

此前仅接受模拟处理的小鼠，在多个组织中都能检测到较高水平的病毒RNA。

而提前感染lowSS10突变体的小鼠，在再次受到野生型病毒攻击后，肠系膜淋巴结中的病毒RNA水平极低，在回肠、结肠和脾脏中则检测不到病毒RNA。

换句话说，在这个小鼠模型中，lowSS10突变病毒虽然明显被“削弱”，却仍然保留了诱导保护性免疫的能力。

这正是活减毒策略最希望获得的组合：

活减毒病毒最怕“变回去”，RNA结构能否提高这道门槛？

活减毒疫苗（live attenuated vaccine）始终绕不开一个问题：遗传稳定性（genetic stability）。

一个减毒病毒如果经过多轮复制后重新获得高复制能力，那么它的安全性就会受到影响。

这项研究的思路与传统的单个位点减毒不同。

研究人员不是依赖某一个关键氨基酸变化，而是在一个RNA结构中同时引入多个核苷酸改变，用多个同义突变共同破坏原有配对关系。

理论上，病毒如果想完全恢复原来的结构，需要同时解决多个位置的配对关系，因此恢复的遗传门槛可能更高。

研究人员将这些结构破坏病毒在细胞中连续传代8轮，并持续测序相应突变区域。

结果没有检测到向原始高毒力序列方向的回复突变（reversion）。

这当然不能等同于“绝不会回复”。

8轮体外传代与真实人群中的长期传播之间还有很大距离。

但至少它提供了一个概念验证（proof-of-concept）：RNA结构本身可以成为设计病毒复制适应度的新变量，而不只是被动观察的分子特征。

这项研究最值得关注的，或许不是一个“疫苗候选物”

如果只把这项工作概括为“研究人员做出了一个减毒诺如病毒”，反而容易低估它。

更重要的变化在于，它扩展了我们理解病毒基因组的方式。

过去看到一个编码区，我们首先会问：它编码什么蛋白？

现在还需要关注：这段RNA本身折叠成什么结构？这种结构会不会影响核糖体进入、病毒RNA复制、亚基因组表达甚至感染适应度？

同一个核苷酸序列，可能同时受到两种约束。

第一种约束来自蛋白质：密码子必须编码合适的氨基酸。

第二种约束来自RNA：这些核苷酸还必须与其他位置正确配对，保持特定空间结构。

于是，一个在蛋白质层面看似“沉默”的同义突变（synonymous mutation），到了RNA结构层面可能完全不沉默。

这也是这项研究最值得延伸思考的地方。

当我们分析病毒进化时，只关注氨基酸变化是否足够？

当我们寻找抗病毒药物靶点时，除了病毒蛋白，稳定而保守的RNA结构是否也值得系统筛选？

而在疫苗设计中，我们是否能够不再依赖长期传代产生随机减毒，而是在充分理解病毒调控网络之后，有目的地降低病毒适应度？

这些问题目前都没有被这项研究最终回答。

尤其需要注意的是：研究对象仍然是鼠诺如病毒，而不是人诺如病毒。

虽然研究人员在人诺如病毒GII型中发现了相似的进化约束区域，但这些区域是否具有相同的结构和功能，目前并没有被直接证明。

此外，研究中的翻译报告系统使用的是加帽RNA（capped RNA），而天然诺如病毒依赖病毒基因组连接蛋白VPg进行翻译起始；报告系统还把局部RNA结构从完整病毒基因组背景中单独取出。因此，实验可以说明调控方向，却未必能精确反映天然感染状态下调控效应的大小。

所以，这项工作距离“设计人用诺如病毒疫苗”还有明显距离。

但它已经证明了一件更基础、也更具有方法学意义的事情：当核苷酸折叠成特定结构后，病毒基因组就多出了一层可以被进化保存、可以被实验扰动，也可能被药物和疫苗设计利用的信息。

未来理解一个RNA病毒，或许不能只读它“写了什么”。还要看它——折成了什么。