仿生磁性纳米机器人结合AI辅助显微成像用于Argonaute驱动的多重食源性病原体检测

食源性病原菌污染一直会对公共健康和食品产业安全造成影响。世界卫生组织的相关数据显示，食源性疾病每年大约会影响6亿人，并造成超过42万人死亡。实际食品样品中的污染情况往往比较复杂，一种样品中有时会同时存在不止一种病原菌，单一目标检测很难及时、完整地反映污染风险。在这样的需求下，研究人员需要开发一种能够在复杂食品基质中完成快速、灵敏、多重检测的技术，这类技术对食品安全监管、企业自检以及冷链流通环节的风险防控都有一定的应用价值。

 目前，食源性病原菌检测主要还是依赖平板培养、免疫分析和PCR等方法。平板培养得到的结果较为可靠，但培养周期通常较长，多重检测能力也比较有限；免疫分析的操作相对简单，不过灵敏度还有不足；PCR有较高的灵敏度和特异性，但它对设备和人员有一定依赖，操作过程相对复杂，检测成本也较高，并且存在气溶胶污染风险。近年来，Argonaute（Ago）蛋白因为具有核酸引导识别和切割能力，逐渐被视为CRISPR之后另一类有发展潜力的分子诊断工具。来源于丁酸梭菌的中温Argonaute蛋白（CbAgo）能在37 ℃条件下高效识别并切割目标DNA，而且不受PAM序列限制，因此它比较适合用于发展多重、便携和现场化检测技术。

 近期，国际期刊《Journal of Agricultural and Food Chemistry》发表了题为“Bionic Magnetic Nanorobots Combined with AI-Assisted Microscopic Imaging for Argonaute-Powered Multiplexed Foodborne Pathogens Detection”的研究论文。研究团队在该研究中构建了一种多重检测平台，该平台把仿生磁性纳米机器人、CbAgo循环切割、聚苯乙烯微球尺寸编码和AI辅助显微成像计数结合到了一起，用于金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）等食源性病原菌的快速检测。

 该平台利用苯硼酸修饰磁性纳米颗粒完成目标菌的快速富集，在20 min内对革兰氏阳性菌的捕获效率能够达到92%以上，并且有25天的储存稳定性。随后，体系利用CbAgo对目标DNA进行识别和切割，再通过不同粒径的聚苯乙烯微球完成信号编码，读数过程则由AI显微图像计数完成。该方法不需要DNA扩增，整体检测能在1.5 h内完成。对于双病原菌检测，平台可以在10²-10⁶ CFU/mL范围内完成多重检测，检测限为10² CFU/mL，与qPCR相比，灵敏度约提升了10倍。

 仿生磁性纳米机器人：用于复杂食品基质的病原菌快速富集工具

 食品样品中常常会有蛋白质、脂肪、多糖、色素和颗粒物等复杂成分。这些基质成分会影响病原菌分离、核酸提取以及后续信号检测。对于低丰度病原菌来说，前处理和富集效率往往会直接决定检测的灵敏度和可靠性。研究团队因此需要构建一种高效、稳定，并且能适用于复杂食品样品的病原菌捕获材料，这也是该研究能够开展后续无扩增检测的重要基础。

该研究设计了苯硼酸-聚乙二醇共修饰磁性纳米颗粒，也就是MNP-PEG-APBA。研究人员先利用EDC/NHS活化羧基磁性纳米颗粒表面，再通过酰胺反应连接氨基-聚乙二醇-羧基（NH2-PEG-COOH），得到MNP-PEG；随后，研究人员再次活化PEG末端羧基，并使其与3-氨基苯硼酸（APBA）反应，最终形成MNP-PEG-APBA仿生磁性纳米机器人。

在这一结构中，PEG链段不仅提高了磁性纳米颗粒的胶体稳定性，也让APBA有了更好的空间柔性和可及性。APBA能够与细菌表面糖蛋白、磷壁酸、脂磷壁酸以及肽聚糖相关糖基结构中的顺式二醇基团发生可逆硼酸酯结合，目标革兰氏阳性菌因此能够被更有效地捕获。

MNP-PEG-APBA结构表征与捕获性能

研究团队通过粒径、电位、扫描电镜和元素分析等方法，对MNP-PEG-APBA的构建结果进行了验证。结果显示，裸磁性纳米颗粒的平均水合粒径约为195.8 nm；PEG修饰后，粒径增至204.8 nm；进一步连接APBA后，粒径增至257.5 nm。这样的变化说明纳米结构在逐步增长。Zeta电位也随着PEG和APBA修饰出现了规律性变化，这进一步证明了表面功能化已经完成。

元素能谱分析检测到了B、C、N、O和Fe等元素。Fe来自磁性纳米颗粒核心，C和O主要来自PEG链段以及APBA骨架，N说明APBA中的氨基结构存在，B元素则直接说明苯硼酸基团已经被成功引入。

在捕获性能方面，SEM图像显示，MNP-PEG-APBA能够明显附着在金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌表面，并形成类似纳米颗粒包覆的结构。与没有引入PEG柔性臂的传统MNP-APBA相比，MNP-PEG-APBA对两种病原菌的捕获效率有了明显提高。其中，金黄色葡萄球菌的捕获效率由约77%提高到87%，单核细胞增生李斯特菌的捕获效率由约85%提高到95%。这一结果说明，PEG间隔臂降低了空间位阻，使APBA能够更容易接触到细菌表面的顺式二醇结构。

研究人员对磁性纳米机器人的用量、孵育时间和磁分离时间进行了优化。最终确定的较优条件为：MNP-PEG-APBA用量70 μL，孵育时间20 min，磁分离时间4 min。在这一条件下，平台对10⁴ CFU/mL金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的捕获效率都能超过90%。

 稳定性与食品样品捕获验证

为了评估材料的实用性，研究团队考察了MNP-PEG-APBA在不同储存时间、pH和温度条件下的捕获稳定性。结果显示，该纳米机器人在4 ℃储存25天后，仍然能够保持超过90%的捕获效率；在pH 5.0-9.0范围内，其捕获效率保持在85%以上，其中pH 7.0-8.0条件下的表现相对较好；在4-37 ℃范围内，捕获效率稳定超过90%。这些结果说明，MNP-PEG-APBA具有较好的储存稳定性、酸碱适应性和温度适应性。

在真实食品基质验证中，研究团队选择了果汁和三文鱼样品。结果显示，在果汁样品中，MNP-PEG-APBA对金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的捕获效率分别为81%和97%；在三文鱼样品中，两者捕获效率分别为77%和95%。液态果汁基质比较均一，纳米颗粒与细菌能够有更充分的接触；三文鱼属于固体复杂基质，其中蛋白质和脂肪含量较高，这些成分可能会在一定程度上影响捕获效率。整体来看，该捕获体系在两类典型食品样品中都保持了较高的富集能力，也为后续无扩增检测提供了质量较好的模板。

 CbAgo解码：不依赖DNA扩增的可编程信号转换

Argonaute蛋白是一类核酸引导内切酶，它能够通过guide DNA（gDNA）与目标序列的碱基互补配对实现特异识别和切割。与部分CRISPR系统不同，Ago识别通常不依赖PAM序列，因此它在多重检测和可编程传感方面具有较高的灵活性。

该研究使用的CbAgo来源于丁酸梭菌，能在37 ℃条件下工作，因而更适合资源受限环境和现场检测。传统CbAgo传感平台大多采用荧光-淬灭探针作为底物，但这种一对一的信号输出模式放大能力有限，荧光探针还容易受到光漂白、背景干扰以及复杂基质中核酸酶降解的影响。

 为了解决这些问题，研究团队把CbAgo切割与聚苯乙烯微球尺寸编码结合了起来。具体来看，不同目标菌对应不同gDNA，也对应不同粒径的聚苯乙烯微球编码探针。金黄色葡萄球菌对应3 μm微球，单核细胞增生李斯特菌对应6 μm微球。微球表面连接目标DNA（tDNA）和生物素，在正常情况下可以通过生物素-链霉亲和素作用与链霉亲和素修饰磁性纳米颗粒（MNP-SA）结合，并被磁分离去除。

 当样品中存在目标菌DNA时，CbAgo会在gDNA引导下识别并切割相关DNA序列，随后进一步触发微球表面tDNA的特异性切割。tDNA被切割后，微球就无法再与MNP-SA有效结合，所以它们会在磁分离后保留在上清液中。上清液中剩余微球数量越多，目标菌浓度也就越高。

聚苯乙烯微球尺寸编码与AI显微计数

 该平台的多重检测能力主要来自聚苯乙烯微球的尺寸编码。研究选择了3 μm和6 μm两种羧基化聚苯乙烯微球，分别偶联不同tDNA-biotin探针，构建出PS3μm-tDNA-biotin和PS6μm-tDNA-biotin编码体系。

 粒径分析显示，tDNA偶联后，微球的水合粒径有所增加，粒径分布仍然保持单峰。这说明偶联过程没有造成明显聚集。Zeta电位结果显示，DNA修饰后微球表面的负电荷增强，这也进一步证明tDNA已经成功连接到微球表面。

 在信号读数方面，研究团队采用普通光学显微镜采集微球图像，并通过AI图像识别算法自动区分和计数不同粒径的微球。与传统荧光通道、多颜色探针或复杂光谱解码相比，尺寸编码结合AI计数的设备门槛更低，多重拓展潜力也更强。不同粒径微球能够作为不同目标菌的数字标签，AI则负责自动识别微球尺寸和数量，多个目标的同步分析由此得以实现。

 循环切割放大提升检测灵敏度

为了进一步提高CbAgo的信号转换效率，研究团队设计了辅助链Reporter 2（R2），并构建了CbAgo介导的循环切割电路。R2的加入能够促进切割反应循环进行，使更多微球表面的tDNA被切割，从而增加上清液中可以被AI计数的微球数量。

 实验结果显示，与未加入R2的体系相比，加入R2后，金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌对应的微球数量都有显著增加，信号约提升了1.5倍。这说明，R2介导的循环切割可以在不进行PCR或RPA等核酸扩增的条件下，实现有效的信号放大。

 在单目标检测中，该平台对金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌均表现出良好的线性响应，检测范围为10¹-10⁶ CFU/mL。金黄色葡萄球菌检测线性方程为Y = 188.82X - 163.56，R² = 0.99；单核细胞增生李斯特菌检测线性方程为Y = 51.4X + 2.87，R² = 0.99。与传统荧光读数方式相比，该微球编码-AI计数策略实现了约3个数量级的灵敏度提升。

 特异性测试显示，大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和植物乳杆菌等非目标菌没有引起明显信号响应，而目标菌能够产生显著的微球计数变化。这一结果说明，该体系具有较好的目标选择性。

 双病原菌多重检测性能

 在完成单目标检测验证后，研究团队进一步评估了平台对金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的同步检测能力。该多重检测体系主要由两个部分组成：显微成像模块负责采集不同粒径微球图像，AI计数模块负责识别3 μm和6 μm微球，并完成自动分类计数。

 结果显示，当两种病原菌浓度同时升高时，对应粒径的微球数量都呈现明显上升趋势，两个通道之间也能够保持独立响应。这表明该平台有较好的多重检测能力。在10²-10⁶ CFU/mL范围内，两种病原菌浓度对数与对应微球数量均呈良好线性关系。金黄色葡萄球菌线性方程为Y = -37.5 + 126.9X，R² = 0.99；单核细胞增生李斯特菌线性方程为Y = -86.6 + 98.9X，R² = 0.99。

 该平台的多重检测限为10² CFU/mL，检测跨度覆盖5个数量级。由于检测流程不需要DNA扩增，整体检测能在1.5 h内完成，检测速度、灵敏度和多重分析能力都得到了兼顾。

 食品样品检测应用

 为了验证实际应用价值，研究团队把不同浓度的金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌加入果汁和三文鱼样品中，并评估平台的回收率和精密度。

 结果显示，金黄色葡萄球菌平均回收率为101.47%-113.20%，总变异系数为11.4%-13.8%；单核细胞增生李斯特菌平均回收率为96.97%-97.95%，总变异系数为12.3%-15.0%。这些数据说明，该方法在液态和固态食品基质中都有较好的检测重复性和中间精密度。

 研究团队还设置了12组果汁和三文鱼盲样，并将该方法与平板计数和qPCR进行了比较。结果显示，该平台能够有效区分阴性和阳性样品，其检测结果与平板计数有较好一致性，而qPCR在部分样品中出现了假阳性或结果高估现象。研究人员认为，这种差异可能与qPCR检测死菌DNA、样品基质中PCR抑制物干扰，以及核酸提取或扩增过程中可能产生的气溶胶污染有关。

 从综合比较来看，平板计数虽然可靠，但通常需要40-48 h；qPCR灵敏度较高，不过它依赖昂贵仪器和专业人员。该平台则通过磁性纳米机器人快速捕获并富集目标菌，再结合CbAgo无扩增识别和AI显微计数读数，在1.5 h内即可完成多重检测，而且单次检测成本低于qPCR，因此它适合进一步向现场筛查场景拓展。

食品中金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌等病原菌的快速检测已经有了比较明确的产品化需求，市面上也已经有相关快速检测试剂盒被用于企业自检、第三方检测和监管抽检场景。与现有商品化快检产品相比，本文介绍的仿生磁性纳米机器人-CbAgo-AI显微成像平台提供了另一种技术路径。磁性纳米机器人负责复杂样品中的病原菌富集，CbAgo完成可编程特异识别，AI显微计数则承担多目标数字化读数。未来，如果研究人员能够进一步实现试剂预制化、便携显微成像和自动化样品处理，该平台有望与现有快检产品形成互补，并为食品中多病原菌同步监测提供更多选择。

 展望

 未来，仿生磁性纳米机器人联合AI显微成像的多重病原菌检测平台，有望成为食品安全快速检测和智能化监测的重要发展方向。该研究将样品富集、核酸识别、信号编码和AI读数整合在同一检测流程中，避免了传统核酸扩增步骤，在降低操作复杂度的同时提高了多重检测能力。特别是CbAgo可在37 ℃条件下工作，相比部分高温Ago体系更适合现场化和资源受限场景。

从应用角度看，该平台适合用于食品加工企业原料筛查、生产过程环境监测、冷链运输节点检测、商超和市场抽检等场景。对于可能存在多种病原菌混合污染的样品，尺寸编码微球和AI计数策略可以实现并行检测，减少漏检和误判风险。

值得关注的是，围绕食品中金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌等食源性病原菌的快速筛查，国内已有较成熟的产品化基础。例如，环凯等企业已推出多类食品微生物快速检测试剂盒和配套检测产品，可服务于食品生产企业自检、第三方检测机构和监管部门日常抽检等场景。与这类成熟商品化快检方案相比，本文介绍的仿生磁性纳米机器人-CbAgo-AI显微成像平台更偏向新型技术储备和多重检测拓展，其优势在于可通过磁性富集降低复杂基质干扰，通过CbAgo实现可编程识别，并借助AI显微计数完成数字化读数。未来若进一步完成试剂预制化、便携化成像和自动化样品处理，该平台有望与环凯等现有快检产品形成互补，为食品中多病原菌同步监测提供更多技术选择。

不过，该技术从实验室走向实际应用仍需进一步优化。首先，磁性纳米机器人制备成本和批间一致性需要系统评估，尤其是APBA密度、PEG链长、磁响应性能和长期储存稳定性对捕获效率的影响。其次，真实食品样品中的脂肪、蛋白质、颗粒物和天然微生物群可能影响磁分离、DNA提取和显微成像质量，未来需要在更多自然污染样品中进行验证。第三，AI显微计数模块需要进一步标准化，包括成像视野数量、光照条件、微球重叠识别、算法泛化能力和便携设备适配性。

此外，该平台具有较强拓展潜力。通过更换gDNA和对应tDNA编码微球，可进一步扩展至沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、副溶血性弧菌、蜡样芽胞杆菌等其他食源性病原菌检测。若引入更多粒径、颜色、荧光或形貌编码微球，还可能实现更高通量的多目标同步检测。未来与微流控芯片、便携式显微镜和边缘AI算法结合后，该平台有望发展为自动化、数字化、低成本的现场病原菌检测系统。

总体来看，该研究提出的仿生磁性纳米机器人-CbAgo-微球编码-AI显微计数平台，实现了食源性病原菌从高效捕获到多重数字化检测的一体化流程。其无需DNA扩增、检测速度快、灵敏度高、多重识别能力强，为复杂食品样品中多病原菌快速筛查提供了一种新型技术方案。结合环凯等成熟快检产品在市场渠道、应用场景和标准化服务方面的基础，未来此类前沿传感技术若能进一步实现产品化，有望推动食品安全检测从单一目标、单一读数向多目标、数字化和智能化方向升级。

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参考文献

[1] Zhang Y, Li L, Feng N, Wang M, Li H, Chen Y. Bionic Magnetic Nanorobots Combined with AI-Assisted Microscopic Imaging for Argonaute-Powered Multiplexed Foodborne Pathogens Detection. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2026. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.6c06438.